膜片鉗常見(jiàn)問(wèn)題解答

1、膜片鉗常見(jiàn)問(wèn)題解答（一）1.什么是電壓鉗與膜片鉗，有什么區(qū)別？答：電壓鉗技術(shù)是通過(guò)向細(xì)胞內(nèi)注射一定的電流，抵消離子通道開(kāi)放時(shí)所產(chǎn)生的離子流，從而將細(xì)胞膜電位固定在某一數(shù)值。由于注射電流的大小與離子流的大小相等、方向相反，因此它可以反映離子流的大小和方向。膜片鉗技術(shù)鉗制的是“膜片”，是指采用尖端經(jīng)過(guò)處理的微電極與細(xì)胞膜發(fā)生緊密接觸，使尖端下的這片細(xì)胞膜在電學(xué)上與其它細(xì)胞膜分離，這大大降低了背景噪聲，使單通道微弱的電流得以分辨出來(lái)。采用電壓鉗技術(shù)將這片膜的電位鉗制在某一數(shù)值，可記錄到單通道電流。從這點(diǎn)上看，膜片鉗技術(shù)是特殊的電壓鉗技術(shù)。隨著膜片鉗技術(shù)的發(fā)展，它已經(jīng)不僅僅局限于“膜片”的概念，也不僅

2、僅采用電壓鉗技術(shù)，還常采用電流鉗技術(shù)。2. 離子通道電導(dǎo)的單位是什么？如何換算？答：離子通道電導(dǎo)的單位是西門(mén)子（Siemens, S），舊稱姆歐，即安培/伏特。常用皮西門(mén)子（pS），1pS10E-12 S，1,000 pS1 pA/mV。3. MultiClamp 700A中，在放大器和信號(hào)器的連接中，放大器的raw output是否需要連接信號(hào)器的 ANALOG IN 接口? scaled output，raw output有什么區(qū)別?答：Raw output為原始信號(hào)輸出，放大器輸出的信號(hào)沒(méi)有經(jīng)過(guò)處理（如濾波、放大等），scaled output為定標(biāo)輸出，輸出的信號(hào)經(jīng)過(guò)了處理。后者的靈活

3、度大，因此多采用。目前膜片鉗放大器多設(shè)有scaled output，你可將其與數(shù)模轉(zhuǎn)換器（你所說(shuō)的信號(hào)器）的ANALOG IN連接，這樣放大器的輸出信號(hào)就能傳送給計(jì)算機(jī)了，此時(shí)已經(jīng)沒(méi)有必要再使用Raw output了。若你想記錄兩個(gè)輸出，則需要將Raw output與數(shù)模轉(zhuǎn)換器的另一個(gè)ANALOG IN連接。4. 在Clampex的Edit protocol/Wave中，Step和ramp各有什么適用范圍？答：Ramp多用于電流衰減緩慢的離子通道以及失敏不明顯的受體通道的I-V曲線制作，如多用于鉀、鈣離子通道。而像鈉通道，其衰減非常迅速，在持續(xù)去極化的情況下，通道很快失活，無(wú)法使用ramp，另

4、外諸如煙堿受體通道等具有明顯失敏特征的受體通道也不宜采用ramp。5. 什么是ramp？有什么作用？答：與步階（step）不同，ramp在pClamp軟件中表示施加給細(xì)胞的一種逐漸變化的電壓或電流，稱為“斜坡電壓或電流”，可用于作通道I-V曲線。膜片鉗常見(jiàn)問(wèn)題解答（二）6. input resistance是什么意思？如何測(cè)量？答：在電生理學(xué)中，“input resistance”指“輸入膜電阻（Rin）”。全細(xì)胞記錄時(shí)，給細(xì)胞膜施加一系列刺激方波（一般為超極化），在離子通道沒(méi)有開(kāi)放的情況下測(cè)定跨膜電流，根據(jù)歐姆定律即可求出Rin。膜電阻（Rm）與膜輸入阻抗Rin的關(guān)系為：Rm4r2 Rin，

5、r為細(xì)胞半徑。7. 在一次電壓鉗全細(xì)胞記錄中，是否每次一定要做電容消除、串連電阻補(bǔ)償、漏減、和液接電位矯正？答：在電壓鉗實(shí)驗(yàn)中，如果需要給予細(xì)胞電刺激來(lái)改變細(xì)胞膜電位（如超極化或去極化），則會(huì)出現(xiàn)膜的被動(dòng)反應(yīng)，產(chǎn)生電容電流與電阻電流，此時(shí)，前者需要用電容補(bǔ)償消除，后者需要用漏減功能消除。全細(xì)胞記錄中，串聯(lián)電阻是必須要補(bǔ)償?shù)模ㄖ辽僖a(bǔ)償80%），除非它很小而忽略不計(jì)。液接電位（一般在10mV左右）也需要校正，除非它很小。你可采用Clampex軟件中的菜單Tools/ Junction Potential功能對(duì)其測(cè)算，然后決定是否需要校正。8. Decay是什么意思？和inactivation有何

6、區(qū)別?答：Decay是“衰減”之意，inactivation是“失活”之意，但在文獻(xiàn)中經(jīng)常混用，decay也常常被說(shuō)成失活，例如鈣電流的衰減常被說(shuō)成失活，這樣用也沒(méi)什么問(wèn)題。但實(shí)際上，兩者細(xì)分的話還是有區(qū)別的。可以將Inactivation分為穩(wěn)態(tài)失活與非穩(wěn)態(tài)失活。后者即Decay，是指在刺激因素（電位變化、施加藥物等）持續(xù)存在下通道的失活，而穩(wěn)態(tài)失活（Steady-state inactivation）一般是指將膜電位鉗制在不同的水平，然后觀察通道的失活情況，做出失活曲線。9. 什么是尾電流，他主要反映通道的什么特性及用在那些方面？答：在離子通道的激活因素（去極化或超級(jí)化）結(jié)束時(shí)通道的關(guān)閉過(guò)

7、程叫做去激活(Deactivation)，所記錄到的電流稱為尾電流（Tail current），主要反映通道的關(guān)閉特征。延遲整流性K+離子通道以及一些不同類型的Ca2+離子通道，它們的尾電流均具有電壓依賴性，關(guān)閉過(guò)程呈指數(shù)分布，可用指數(shù)方程擬合而獲得通道關(guān)閉過(guò)程的時(shí)間常數(shù)。尾電流的分析對(duì)研究電壓門(mén)控性離子通道的激活、關(guān)閉、失活等動(dòng)力學(xué)過(guò)程很有幫助。如研究尾電流幅度與脈沖電壓的關(guān)系、脈沖電壓的不同持續(xù)時(shí)間或尾電流不同的鉗制電壓對(duì)尾電流幅度、衰減時(shí)間常數(shù)的影響等等。通過(guò)這些研究可了解通道關(guān)閉過(guò)程中出現(xiàn)的不同關(guān)閉狀態(tài)。藥物可影響通道的關(guān)閉過(guò)程，表現(xiàn)為尾電流的衰減過(guò)程變快或變緩慢。10. 如何理解st

8、eady state activation中的steady state 的意義？答：“steady state”是“穩(wěn)態(tài)”的意思。一般通過(guò)給予細(xì)胞持續(xù)一定時(shí)間的一系列去極化（多為去極化）脈沖來(lái)激活離子通道，記錄通道電流峰值，再計(jì)算岀電導(dǎo)G，作出G-V曲線，該曲線稱為穩(wěn)態(tài)激活曲線，也就是我們常說(shuō)的激活曲線。膜片鉗常見(jiàn)問(wèn)題解答（三）11. 電極拉制程序中具體應(yīng)該如何控制。在參數(shù)設(shè)定的摸索中，是否需要每次都用顯微鏡檢測(cè)，還是另有更易操作的方法.答：不同的拉制儀拉制參數(shù)的設(shè)置不盡相同，你需要閱讀說(shuō)明書(shū)，參數(shù)中主要是設(shè)定拉力（對(duì)于P-97拉制儀，只需要設(shè)置Velocity，可不用設(shè)定Pull）與溫度。一

9、般第一步拉制電極頸部，溫度要比第二步高（對(duì)于P-97拉制儀，溫度的設(shè)定需要先測(cè)量Ramp值），拉力不要過(guò)大，以保證頸部較短；第二步拉制尖端，一般要使溫度低些，拉力大些。一般都是通過(guò)顯微鏡查看電極尖端，這很簡(jiǎn)單，并不復(fù)雜！最好是拋光，這樣就在拋光儀顯微鏡下查看。注意拋光后的電極尖端開(kāi)口會(huì)變小，故在拉制電極時(shí)，尖端開(kāi)口要大些。檢查電極還有其它方法，如“氣泡數(shù)法”，也可用放大器通過(guò)測(cè)量電阻來(lái)查看。12. Rm4r2Rin？似乎Rin是一個(gè)用細(xì)胞大小標(biāo)化的膜電阻，那為什么不用電容Cm來(lái)標(biāo)化而用這個(gè)什么4r2？細(xì)胞形狀各異，Cm是個(gè)公認(rèn)的膜面積的指標(biāo)，電流密度不就是用Cm標(biāo)化的嗎？盼回答，同時(shí)希望能將R

10、in的意義再多講一點(diǎn)，謝謝答：（1）一定要注意不要拘泥于Rm和Rin這兩個(gè)符號(hào)，文獻(xiàn)中?；煊?，但實(shí)際上表示的大多是Rin。通常我們所說(shuō)的“膜電阻”是指“膜輸入阻抗Rin”，但也有人用來(lái)指Rm。（2）你可以用Cm來(lái)計(jì)算膜面積，實(shí)際上這也正是我們的做法，用來(lái)估算細(xì)胞大小，用于對(duì)通道電流幅度進(jìn)行標(biāo)化，但我們從來(lái)不用它計(jì)算膜電阻Rm（也稱為“固有膜電阻”）。Rm的計(jì)算公式是數(shù)學(xué)理論上的，并沒(méi)有多少應(yīng)用的價(jià)值，我們很少發(fā)現(xiàn)有使用Rm的（雖然符號(hào)用Rm）。（3）實(shí)際上，Rin反映的當(dāng)然就是膜電阻，它被稱為膜輸入阻抗（或膜輸入電阻），也時(shí)常被稱為“膜電阻”（這正是使人們產(chǎn)生混淆的原因?。悄さ谋粍?dòng)反應(yīng)參數(shù)

11、之一。所謂被動(dòng)反應(yīng)是指膜上離子通道沒(méi)有開(kāi)放時(shí)，膜所表現(xiàn)出的電纜特性。膜的被動(dòng)反應(yīng)參數(shù)還包括膜電容、軸漿電阻等。全細(xì)胞記錄時(shí)，給細(xì)胞膜施加一系列刺激方波（多為超極化），在離子通道沒(méi)有開(kāi)放的情況下測(cè)定跨膜電流，根據(jù)歐姆定律可求出Rin。當(dāng)大量離子通道開(kāi)放時(shí)，膜對(duì)電流的阻力急劇降低，測(cè)試脈沖電壓與通道電流之間不滿足歐姆定律，無(wú)法測(cè)量Rin，也沒(méi)有了測(cè)量的意義。13. 請(qǐng)教什么是Channel availability？答：Channel availability指在排除失活情況下，能夠開(kāi)放的某通道的多少，通過(guò)全細(xì)胞電流幅度的大小來(lái)反映。例如，海馬神經(jīng)元Na通道的channel availabilit

12、y可因乙酰膽堿M受體的激活而降低，表現(xiàn)為Na通道電流幅度的降低。14. 什么是window current，我知道是激活曲線和失活曲線的重疊。但是我有一個(gè)疑問(wèn)，比如電壓依賴的T型鈣通道，書(shū)上說(shuō)在windonw current的時(shí)候有持續(xù)性的鈣內(nèi)流，但是T性鈣通道不是有時(shí)間依賴性的失活嗎？怎么會(huì)有不失活的電流呢？答：如果將通道的穩(wěn)態(tài)激活曲線與失活曲線作在一個(gè)圖上，則激活曲線與失活曲線之間交叉部分的電流就是window current，在這個(gè)電壓范圍內(nèi)，有一些通道并沒(méi)有完全失活，仍能被打開(kāi)，有一定的開(kāi)放概率。T性鈣通道是有時(shí)間依賴性的失活，但還有很小的部分失活非常緩慢，此即window curre

13、nt，它是一些快速失活通道的動(dòng)力學(xué)特征。對(duì)于T型鈣通道，其window current維持了一個(gè)緊張性去極化，對(duì)動(dòng)作電位的連續(xù)發(fā)放產(chǎn)生影響，當(dāng)然，不同細(xì)胞中的T通道其作用不盡相同。15. 使用Clampex 8.0記錄配體門(mén)控離子通道電流，protocol 如何設(shè)置?答：需要事先在Lab Bench中設(shè)定好Channel序號(hào)和Signal名稱。在Edit Protocol中選擇Gap-free模式，采樣頻率可用5kHz，選好Input和Output。先在Clampex中啟動(dòng)記錄（Record），然后誘發(fā)電流，可用Time Tag作誘發(fā)標(biāo)記。膜片鉗常見(jiàn)問(wèn)題解答（四）16. 電極內(nèi)液中加入1mmo

14、l/L的EGTA和10mmol/L的EGTA有什么區(qū)別?答：EGTA一般用10 mM左右（1 mM太低），促進(jìn)封接，鰲和內(nèi)鈣。17. 什么是漏電流，為什么要做Leak subtraction？答：漏電流的概念比較混亂，可以指封接電流（封接時(shí)從封接處“漏掉”的電流），也可指放大器的系統(tǒng)偏差，還可指膜漏電流。一般來(lái)講，膜漏電流是細(xì)胞膜的被動(dòng)反應(yīng)電流，是非離子通道電流，因此在記錄離子通道電流時(shí)要將它去除。膜片鉗放大器與采樣分析軟件都具有將其去除的漏減功能。18. 請(qǐng)問(wèn)動(dòng)作電位是否一定要有越過(guò)0的超射，我在一篇文獻(xiàn)中看到作者將一個(gè)沒(méi)有超射的電位變化也稱為動(dòng)作電位，我覺(jué)得不對(duì)，應(yīng)該是閾下反應(yīng)才對(duì)吧？但又

15、不敢下結(jié)論，覺(jué)得國(guó)外文獻(xiàn)不該出錯(cuò)。答：一般生理情況下動(dòng)作電位都含有超射，超射與Na離子（或Ca離子）的平衡電位有關(guān)。但在具體實(shí)驗(yàn)中（或某些病理情況下），若細(xì)胞內(nèi)外液的Na離子（或Ca離子）的濃度發(fā)生變化，則Na離子（或Ca離子）的平衡電位也隨之變化，就可能不產(chǎn)生超射或超射值更大。19. 我想請(qǐng)教一下為什么我們用培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元記錄NMDA電流，總是會(huì)出現(xiàn)電流的衰減，而且我們記錄是選擇的培養(yǎng)第10-14天的大鼠，可是電流大小不等，具體在100-1500pA間波動(dòng)，這讓我們很疑惑，注明一下，電極內(nèi)液中我們用了CsCl和ATP、GTP。答：電流大小不等與細(xì)胞大小、細(xì)胞狀態(tài)等都有關(guān)，另外更重要的可

16、能與你的給藥方法有關(guān)，不知你采用的是哪種給藥方法？正常情況下，連續(xù)誘發(fā)受體電流會(huì)存在失敏，表現(xiàn)為電流的衰減（幅度減?。绻谟涗涍^(guò)程中細(xì)胞狀態(tài)逐漸不好，也會(huì)出現(xiàn)這種情況。我們認(rèn)為你所選用的細(xì)胞培齡沒(méi)有問(wèn)題，內(nèi)液也沒(méi)問(wèn)題。20. 腦片實(shí)驗(yàn)中，ACSF的配方中的Mg離子，有的用的MgSO4，有的用的MgCl2，他們有什么區(qū)別？有關(guān)滲透壓，有的配方是295 mOsm，有的300多mOsm，他們又有什么區(qū)別？如何調(diào)整ACSF的滲透壓？答：用MgSO4和用MgCl2沒(méi)多大區(qū)別，但如果要記錄Cl電流，就要有所考慮；另外若所需要的Mg濃度有大的變化，也要考慮到Cl和SO4離子所可能帶來(lái)的問(wèn)題。滲透壓有個(gè)

17、范圍，一般在290320之間都沒(méi)有問(wèn)題，精確地測(cè)量與調(diào)節(jié)滲透壓需要特殊的滲透壓儀，但一般都是通過(guò)離子強(qiáng)度進(jìn)行計(jì)算，只要大體在上述范圍就行。膜片鉗技術(shù)在神經(jīng)藥理方面的應(yīng)用（1）1976 年Neher 和Sakmann 建立了膜片鉗技術(shù)（Patch clamp technique），這是一種以記錄通過(guò)離子通道的離子電流來(lái)反映細(xì)胞膜上單一的或多數(shù)的離子通道分子活動(dòng)的技術(shù)。1981 年Hamill, Neher 等人又對(duì)膜片鉗實(shí)驗(yàn)方法和電子線路進(jìn)行了改進(jìn)，形成了當(dāng)今廣泛應(yīng)用的膜片鉗實(shí)驗(yàn)技術(shù)。該技術(shù)可應(yīng)用于許多細(xì)胞系的研究，也是目前唯一可記錄一個(gè)蛋白分子電活動(dòng)的方法，膜片鉗技術(shù)和克隆技術(shù)并駕齊驅(qū)給生命科

18、學(xué)研究帶來(lái)了巨大的前進(jìn)動(dòng)力，這一偉大的貢獻(xiàn)，使Neher 和Sakmann 獲得1991 年諾貝爾醫(yī)學(xué)與生理學(xué)獎(jiǎng)。一 膜片鉗技術(shù)的基本原理用一個(gè)尖端直徑在1.53.0m 的玻璃微電極接觸細(xì)胞膜表面，通過(guò)負(fù)壓吸引使電極尖端與細(xì)胞膜之間形成千兆歐姆以上的阻抗封接，此時(shí)電極尖端下的細(xì)胞膜小區(qū)域（膜片，patch）與其周圍在電學(xué)上分隔，在此基礎(chǔ)上固定（鉗制，Clamp）電位，對(duì)此膜片上的離子通道的離子電流進(jìn)行監(jiān)測(cè)及記錄。基本的儀器設(shè)備有膜片鉗放大器、計(jì)算機(jī)、倒置顯微鏡、示波器、雙步電極拉制器、三軸液壓顯微操縱器、屏蔽防震實(shí)驗(yàn)臺(tái)、恒溫標(biāo)本灌流槽、玻璃微電極研磨器。膜片鉗放大器是離子單通道測(cè)定和全細(xì)胞記錄

19、的關(guān)鍵設(shè)備，具有高靈敏度、高增益、低噪音及高輸入阻抗。膜片鉗放大器是通過(guò)單根電極對(duì)細(xì)胞或膜片進(jìn)行鉗制的同時(shí)記錄離子流經(jīng)通道所產(chǎn)生的電流。膜片鉗放大器的核心部分是以運(yùn)算放大器和反饋電阻構(gòu)成的電流-電壓（I-V）轉(zhuǎn)換器，運(yùn)算放大器作為電壓控制器自動(dòng)控制，使鉗制電位穩(wěn)定在一定的水平上。膜片鉗技術(shù)在神經(jīng)藥理方面的應(yīng)用（2）二 操作步驟 膜片鉗微電極制作(1) 玻璃毛細(xì)管的選擇：有二種玻璃類型，一是軟質(zhì)的蘇打玻璃，另一是硬質(zhì)的硼硅酸鹽玻璃。軟質(zhì)玻璃在拉制和拋光成彈頭形尖端時(shí)錐度陡直，可降低電極的串聯(lián)電阻，對(duì)膜片鉗的全細(xì)胞記錄模式很有利；硬質(zhì)玻璃的噪聲低，在單通道記錄時(shí)多選用。玻璃毛細(xì)管的直徑應(yīng)符合電極支

20、架的規(guī)格，一般外部直徑在1.11.2mm。內(nèi)徑1mm。(2) 電極的拉制：分二步拉制。第一部是使玻璃管中間拉長(zhǎng)成一窄細(xì)狀，第二次拉制窄細(xì)部位斷成二根，其尖端直徑一般在15m，充入電極內(nèi)液后電極電阻在15M為宜。調(diào)節(jié)第一步和第二步拉制時(shí)加熱線圈的電流強(qiáng)度，即可得到所需要的電極尖端直徑。電極必須保持干凈，應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)拉制。(3) 涂硅酮樹(shù)酯：記錄單通道電流時(shí)，為了克服熱噪聲、封接阻抗噪聲及電極浸入溶液產(chǎn)生的浮游電容性噪聲，需要在電極尖頸部（距離微電極尖端50mm）的表面薄薄地涂一層硅酮樹(shù)酯（sylgard），它具有疏水性、與玻璃交融密切、非導(dǎo)電性的特性。涂完硅酮樹(shù)酯的玻璃微電極須通過(guò)加熱的鎳鉻電阻線圈

21、烘干變固，以防硅酮樹(shù)酯順著電極流向尖端而影響千兆封接。烘干后才能進(jìn)行熱磨光。(4) 熱磨光(heat polish)：一般在玻璃研磨器下對(duì)電極尖端進(jìn)行熱磨光，磨光后可使電極尖平滑并燒去過(guò)多的硅酮樹(shù)酯薄膜，有利于千兆封接的形成。目前大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室在作全細(xì)胞模式記錄時(shí)，不涂硅酮樹(shù)酯也不進(jìn)行熱磨光，也可形成很好的千兆封接。(5) 電極液的充灌：目前最常應(yīng)用的是用注射器反向充灌。用細(xì)長(zhǎng)的注射器針頭或拉細(xì)的聚乙烯膠管從電極尾端插入到電極尖端，再進(jìn)行灌注。灌注后電極尖端有少許氣泡，排除氣泡的方法是用左手拿住電極，尖端向下，用右手輕輕彈擊電極，可見(jiàn)氣泡徐徐上升直至排除。電極液不要充灌太滿，能與探頭的銀絲接觸上

22、即可，溶液過(guò)多會(huì)浸入探頭支持架致使潮濕而影響實(shí)驗(yàn)記錄。膜片鉗技術(shù)在神經(jīng)藥理方面的應(yīng)用（3） 溶液的組成(1) 電極液：根據(jù)記錄的電流不同電極液的成分也不同。基本要求是等張的KCI 溶液，Ca2+ 濃度為10100nmol (pCa 78)，pH 值77.4。這里介紹一個(gè)在全細(xì)胞記錄模式時(shí)，通過(guò)改變保持電位，能分別記錄到Na+、K+、Ca2+ 電流的電極液成分(mmol/L)：K Aspartic 49.89，KCI 30.37， KH2PO4 25，HEPES 20.12，EGTA 0.999，KOH 29.95，MgCI2 1，CaCI2 0.2，ATPNa2 6.8。用KOH 調(diào)pH 至7

23、.4。如果要記錄純的Na+、K+、Ca2+ 電流，則需要使用相應(yīng)的工具藥。HEPES（N-2-hydroxyethyopiperazine-N-2-ethanesulfonic acid，羥乙基哌嗪乙烷磺酸）(2) 細(xì)胞外液（浴槽液）：分離細(xì)胞和記錄電流時(shí)應(yīng)用。分離神經(jīng)細(xì)胞主要用人工腦脊液（artificial cerebrospinal fluid solution，ACSF），成分（mmol/L）：NaCI 124，KCI 2.5，NaH2PO4 1.25，MgSO4 2.0，CaCI2 2，NaHCO3 26，glucose 10。該液體需要通以95%O25%CO2 混合氣體。如果用HE

24、PES 作緩沖系，則ACSF 的成分如下（mmol/L）：NaCI 140，KCI 2.5，MgCI2 1，CaCI2 1，glucose 25，HEPES 10。上述溶液的配制均使用去離子水。膜片鉗技術(shù)在神經(jīng)藥理方面的應(yīng)用（4） 神經(jīng)細(xì)胞的分離運(yùn)用膜片鉗技術(shù)進(jìn)行電生理學(xué)研究需要制備合適的單個(gè)細(xì)胞作標(biāo)本，細(xì)胞制備的好壞直接影響實(shí)驗(yàn)的成功率。膜片鉗實(shí)驗(yàn)要求細(xì)胞標(biāo)本具有呼吸活性、耐鈣、細(xì)胞膜完整、平滑、清潔度高的條件，以利于微電極與細(xì)胞膜進(jìn)行高阻封接?；钚院玫募?xì)胞在形成全細(xì)胞模式后可以保持活性很長(zhǎng)時(shí)間，足以保證實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。因此制備好的細(xì)胞標(biāo)本是膜片鉗實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵第一步。七十年代以來(lái)，出現(xiàn)了許多分

25、離各類細(xì)胞的分離技術(shù)，但是進(jìn)行電生理學(xué)研究尤其是膜片鉗實(shí)驗(yàn)多應(yīng)用酶解分離細(xì)胞的方法。我們實(shí)驗(yàn)室曾分離過(guò)豚鼠心室肌細(xì)胞、大鼠肝臟細(xì)胞、大鼠腦皮層神經(jīng)細(xì)胞、家兔肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞和人腦皮層神經(jīng)細(xì)胞及人心房肌細(xì)胞。這里重點(diǎn)介紹大鼠腦皮層神經(jīng)細(xì)胞的分離技術(shù)。(1) 用30mg/kg 戊巴比妥鈉ip 麻醉后，斷頭開(kāi)顱取出大腦半球放入冷的人工腦脊液中，輕輕剝離腦膜和血管等纖維組織，然后取腦皮層在人工腦脊液中剪成2mm2mm 的組織塊靜止小時(shí)，并通以氧氣。(2) 將腦組織塊放入含有protease 16unit/ml ( type , sigma )和protease 2unit/ml (type , sig

26、ma)的人工腦脊液中，在36恒溫震蕩(60 次/min)水浴中孵育60 分鐘左右。(3) 將組織塊取出，反復(fù)用人工腦脊液沖洗次，以徹底清除消化酶，于室溫下靜止60 分鐘并繼續(xù)通氧，實(shí)驗(yàn)前將組織塊輕柔吹打后即可分離出單一的神經(jīng)細(xì)胞供實(shí)驗(yàn)使用。膜片鉗技術(shù)在神經(jīng)藥理方面的應(yīng)用（5） 千兆歐姆封接取一滴細(xì)胞液，滴入浴槽中，用人工腦脊液進(jìn)行灌流，將浮游的死細(xì)胞沖走，待細(xì)胞貼壁后即可進(jìn)行封接吸引。通過(guò)PCLAMP 軟件或電子刺激器，給予一個(gè)20mV，1050ms的矩形波刺激，當(dāng)電極進(jìn)入浴槽溶液時(shí)，記錄電流的直線變成與矩形波電壓脈沖相對(duì)應(yīng)的矩形波曲線，將電極尖輕輕壓在細(xì)胞膜表面，此時(shí)電流曲線的高度變低，給電

27、極以負(fù)壓吸引，由于電極尖與細(xì)胞膜逐漸密接，細(xì)胞膜與電極間的電阻逐漸增加，電流曲線逐漸減小直至變成一條直線，則形成了千兆歐姆封接。膜片鉗技術(shù)在神經(jīng)藥理方面的應(yīng)用（6）5記錄模式根據(jù)研究目的選擇記錄模式，主要有下面敘述的前種，后種是依據(jù)前種變更而來(lái)的。(1) 細(xì)胞貼附式 (cell-attached 或on-cell mode)：千兆歐姆封接后的狀態(tài)即為細(xì)胞貼附式模式，是在細(xì)胞內(nèi)成分保持不變的情況下研究離子通道的活動(dòng)，進(jìn)行單通道電流記錄。即使改變細(xì)胞外液對(duì)電極膜片也沒(méi)有影響。(2) 膜內(nèi)面向外式 (inside-out mode)：在細(xì)胞貼附式狀態(tài)下將電極向上提，電極尖端的膜片被撕下與細(xì)胞分離，形

28、成細(xì)胞膜內(nèi)面向外模式。此時(shí)膜片內(nèi)面直接接觸浴槽液，灌流液成分的改變則相當(dāng)于細(xì)胞內(nèi)液的改變。可進(jìn)行單通道電流記錄。此模式下細(xì)胞質(zhì)容易滲漏(washout)，影響通道電流的變化，如Ca2+ 通道的run-down 現(xiàn)象。(3) 全細(xì)胞式 (whole-cell mode) 記錄： 在細(xì)胞貼附式狀態(tài)下增加負(fù)壓吸引或者給予電壓脈沖刺激 (zapping)，使電極尖端膜片在管口內(nèi)破裂，即形成全細(xì)胞記錄模式。此時(shí)電極內(nèi)液與細(xì)胞內(nèi)液相通成為和細(xì)胞內(nèi)電極記錄同樣的狀態(tài)，不僅能記錄一個(gè)整體細(xì)胞產(chǎn)生的電活動(dòng)，并且通過(guò)電極進(jìn)行膜電位固定，也可記錄到全細(xì)胞膜離子電流。這種方式可研究直徑小于20m 以下的小細(xì)胞的電活動(dòng)

29、；也可在電流鉗制 (current clamp)下測(cè)定細(xì)胞內(nèi)電位。目前將這種方法形成的全細(xì)胞式記錄稱作常規(guī)全細(xì)胞模式 (conventional whole-cellmode 或hole cell mode)。(4) 膜外面向外式 (outside-out mode)：在全細(xì)胞模式狀態(tài)下將電極向上提，使電極尖端的膜片與細(xì)胞分離后又粘合在一起，此時(shí)膜內(nèi)面對(duì)電極內(nèi)液，膜外接觸的是灌流液。可在改變細(xì)胞外液的情況下記錄單通道電流。(5) 開(kāi)放細(xì)胞貼附膜內(nèi)面向外式 (open cell-attached inside-out mode)：在細(xì)胞貼附式狀態(tài)下，用機(jī)械方法將電極膜片以外的細(xì)胞膜破壞，從這個(gè)破

30、壞孔調(diào)控細(xì)胞內(nèi)液并在細(xì)胞貼附式狀態(tài)下進(jìn)行單通道電流記錄。用這種方法時(shí)，細(xì)胞越大，破壞孔越小，距電極膜片越遠(yuǎn)，細(xì)胞因子的流出越慢。穿孔膜片式 (perforated patch mode) 或緩慢全細(xì)胞式 (slow whole-cell mode)：在全細(xì)胞式記錄時(shí)由于電極液與細(xì)胞內(nèi)液相通，胞內(nèi)可動(dòng)小分子能從細(xì)胞內(nèi)滲漏到電極液中。為克服此缺點(diǎn)，可在膜片電極內(nèi)注入制霉菌素 (nystatin) 或二性霉素 (amphotericin使電極膜片形成多數(shù)導(dǎo)電性小孔，進(jìn)行全細(xì)胞膜電流記錄，故被稱為穿孔膜片式或制霉菌素膜片式 (nystatin-patch mode)。又因胞質(zhì)滲漏極慢，局部串聯(lián)阻抗較常

31、規(guī)全細(xì)胞記錄模式高，鉗制速度慢，故也稱為緩慢全細(xì)胞式。(7) 穿孔囊泡膜外面向外式 (perforated vesicle outside-out mode)：在穿孔膜片式基礎(chǔ)上，將電極向上提，使電極尖端的膜片與細(xì)胞分離后又粘合在一起形成一個(gè)膜囊泡。如果條件很好，在囊泡內(nèi)可保留細(xì)胞質(zhì)和線粒體等，能在比較接近正常的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝的條件下進(jìn)行單通道記錄。6. 細(xì)胞內(nèi)灌流方法：細(xì)胞內(nèi)灌流是在全細(xì)胞式狀態(tài)下利用電極內(nèi)灌流法形成的。電極內(nèi)灌流法的裝置是由電極固定部、灌流液槽、注入管、流出管、電極記錄用瓊脂橋所組成。注入管是用直徑2.5 mm 的塑料管經(jīng)加熱拉細(xì)制成，使其尖端能插到接近電極的尖頂部。

32、灌流液槽注滿實(shí)驗(yàn)用溶液，插入注入管，當(dāng)千兆封接形成后，由于負(fù)壓吸引的作用電極內(nèi)液從流出管流入排液槽的同時(shí)，實(shí)驗(yàn)用溶液由流入管注入到電極內(nèi)，電極充滿實(shí)驗(yàn)用溶液后關(guān)閉注入管，完成了液體的交換。這種方法應(yīng)用在“內(nèi)面向外式”時(shí)，可同時(shí)改變細(xì)胞內(nèi)液和細(xì)胞外液的組成；應(yīng)用在“全細(xì)胞式”時(shí)就形成了細(xì)胞內(nèi)灌流方法，直接改變了細(xì)胞內(nèi)液。膜片鉗技術(shù)在神經(jīng)藥理方面的應(yīng)用（7）7. 全細(xì)胞記錄模式離子通道電流記錄(1) 鈉通道電流 (INa)： 灌流液即細(xì)胞外液同人工腦脊液液，也可加入CoCl2 3 mmol/L或nifidipine 10mol/L 以阻斷鈣電流。電極液成分(mmol/L)：CsCl 150, EG

33、TA 11, CaCl2 1,MgCl2 1, HEPES 10, 用CsOH 調(diào)pH 至7.4。電壓鉗制方案，通常設(shè)保持電位 (holding potential) 為-80 mV，去極化電壓為 -10+40mV，步階電壓10 mV，去極化的保持時(shí)間（刺激脈沖寬度或鉗制時(shí)間）1040 ms。當(dāng)全細(xì)胞記錄方式形成后，利用上述電壓鉗制方案，即可記錄出INa。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)制作電流-電壓 (current-voltage, I-V) 關(guān)系曲線，從中找到Na+ 電流的激活電位、反轉(zhuǎn)電位和最大電流的電壓區(qū)域。(2) 鈣通道電流 (ICa)：灌流液有兩種方案，一是人工腦脊液中加入TTX 10mol/L，另

34、一是將人工腦脊液中的NaCl 換成N-methyl-D-glucamine 130mol/L, pH 用CsOH 調(diào)至7.4。電極液的組成(mmol/L)：Aspartic acid 60, CsOH 60, MgCl2 4, HEPES 10, EGTA 10, Na2ATP 3。用CsOH 調(diào)pH 至7.4。通常使用的電壓鉗制方案是設(shè)保持電位為-40 mV，去極化電壓為10110 mV，步階電壓10 mV, 鉗制時(shí)間300 ms，此方案記錄的是L 型Ca2+ 通道電流；但在此保持電位下記錄到的Ca2+ 電流尚含有Na+ 通道電流或尚有T 型Ca2+ 通道電流。記錄由于沒(méi)有特異的T 型Ca2

35、+ 通道阻滯劑，若想獲得較純凈的L 型Ca2+ 通道電流，將保持電位抬高到-30 mV 即可。記錄T 型Ca2+ 通道電流的電壓鉗制方案是設(shè)保持電位為-80 mV，仍以10 mV 的步階電壓去極，去極化電壓為10170 mV，應(yīng)用L 型Ca2+ 通道阻滯劑，如：nitrendipine、nisodipine、nifedipine 等，即可得到較純凈的T 型Ca2+ 通道電流。兩種方案得出的膜電流峰值，均可繪制I-V 曲線。(3) 鉀通道電流：神經(jīng)細(xì)胞上亦存在多種K+ 通道，其研究也很復(fù)雜，通常最直觀最容易觀察和記錄得到的K+ 通道電流不外乎幾種。這里僅就延遲整流通道、內(nèi)向整流通道及瞬間外向電流

36、通道的電流記錄加以介紹?；疽后w 灌流液的組成 (mmol/L)： N-methyl-D-glucamine 135, KCl 5.4, CaCl 1.8,MgCl2 0.5, HEPES 10, Glucose 5.5。用HCl 調(diào)pH 至7.4。也可在灌流液中加入TTX(10-6mol/L)和Cd+ (0.20.5mmol/L)，以阻斷Na+ 和Ca2+ 通道。電極溶液為通常的細(xì)胞內(nèi)液。 延遲外向整流電流 (delayed rectifier outward current, Ikr)：設(shè)保持電位為 80 mV，去極化電壓為 -20+170 mV，步階電壓10 mV, 鉗制時(shí)間可這在100

37、400 ms，時(shí)間間隔為23ms 以上。有時(shí)可將保持電位設(shè)在 30 mV 或 40 mV，這樣不僅可以使T 型Ca2+ 通道失活，記錄出Ikr，而且也可以同時(shí)記錄到尾電流 (Itail)，尾電流也是延遲外向整流電流的一種表現(xiàn)形式，當(dāng)鉗制方波從 +70 mV 或 +90 mV 復(fù)極到保持電位時(shí)，這個(gè)電流并不緊隨，而是延遲于復(fù)極的鉗制方波，以指數(shù)衰減方式，逐漸回至電流基線。現(xiàn)認(rèn)為Itail 和Ikr 使用同一通道。Ikr 值的表示，通常是測(cè)定鉗制方波就要結(jié)束時(shí)的外向電流幅值；Itail 的測(cè)定是在鉗制初期上升的幅值。 內(nèi)向整流電流 (inward rectifier current, Ikir)：

38、在膜超極化時(shí)內(nèi)向整流通道開(kāi)放，K流入細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)膜電位近于靜息電位或更正時(shí)，該通道趨于關(guān)閉。一般情況下保持電位的設(shè)置與細(xì)胞的靜息電位相當(dāng)，設(shè)在 80 mV，在這個(gè)電位下，膜電位為“零”，保持電位是“零”電流電位。然后令鉗制電位從正于保持電位的方向，向超極化方向復(fù)極，超極化可達(dá)-140 mV 到 160 mV，過(guò)度超極化可能會(huì)損傷細(xì)胞，步階電壓仍為10 mV在神經(jīng)細(xì)胞，Ikir 于鉗制初期可表現(xiàn)出一個(gè)瞬間內(nèi)向電流，很快衰減，之后趨于平衡，形成時(shí)間不依賴性或稱為持續(xù)性電流。測(cè)量電流幅度是測(cè)瞬間電流峰值和持續(xù)性電流峰值。分別繪制其I-V 曲線，再做分析。 瞬間外向電流 (transient outwa

39、rd current, IA 或Ito)： 用于記錄Ito 的電壓鉗制方案與延遲整流電流的方案基本一樣，通常將保持電位設(shè)在 80 mV，但這種電壓鉗制方案在記錄到的Ito 中，一定混有Ikir。目前可用兩種方法將其分開(kāi)。第一，設(shè)置兩個(gè)電壓鉗制方案，即：第一個(gè)方案中的保持電位為 80 mV，鉗制電位為 +50 mV 或更高，時(shí)間為80100ms，目的在于最大程度地記錄到Ito。第二，如用改變保持電位的方法仍不能分開(kāi)Ito 和Ikir，則可用某些阻斷劑 (如E-4031、TEA 等) 阻斷Ikir，然后利用方案一記錄Ito。然而，實(shí)際上要得到較純凈的Ito 是相當(dāng)不容易的，這其中包括：在某些細(xì)胞Ito 和Ikir 對(duì)膜電位的依賴性太接近，以及到目前為止尚未有十分特異的Ikir 阻斷劑。由于TEA 這類阻斷劑的特異性差，所有應(yīng)用時(shí)要格外小心，應(yīng)使用特異性較好的阻斷劑。在K+ 通道的研究中，也可應(yīng)用斜坡 (ramp) 鉗制方案。其基本要點(diǎn)是膜電位斜坡除極的速度不要太快。通