頸椎后縱韌帶膠原、蛋白多糖、鈣含量變化的研究

1、頸椎后縱韌帶膠原、蛋白多糖、鈣含量變化的研究    【摘要】  目的通過(guò)定量測(cè)定頸椎后縱韌帶總膠原、型膠原、型膠原、蛋白多糖和鈣含量改變，探討頸椎后縱韌帶在頸椎病發(fā)病機(jī)理中的意義。方法收集脊髓型頸椎病下位頸椎后縱韌帶15例作試驗(yàn)組，同年齡段正常下位頸椎后縱韌帶10例作對(duì)照，Weossner法測(cè)定兩組總膠原含量；酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定型、型膠原含量；間苯三酚分光光度法測(cè)定蛋白多糖含量；甲基百里香酚藍(lán)比色法測(cè)定鈣含量；進(jìn)行HE染色和Masson染色，對(duì)比觀察后縱韌帶的顯微結(jié)構(gòu)變化特點(diǎn)。結(jié)果試驗(yàn)組總膠原、型膠原和蛋白多糖含量低于對(duì)照組；試驗(yàn)組型膠原含量較

2、對(duì)照組高；試驗(yàn)組型/型膠原比值低于對(duì)照組；試驗(yàn)組鈣含量較對(duì)照組高，組間對(duì)比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；病理結(jié)構(gòu)顯示試驗(yàn)組彈力纖維、膠原纖維腫脹，排列紊亂。結(jié)論頸椎病患者頸椎后縱韌帶退變，總膠原、型膠原、型膠原、蛋白多糖和鈣代謝發(fā)生紊亂，頸椎后縱韌帶分子水平的生物化學(xué)變化與頸椎病發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。 【關(guān)鍵詞】  頸椎??； 后縱韌帶； 膠原； 蛋白多糖； 鈣化頸椎病是以頸椎間盤(pán)退變?yōu)橹饕∽兓A(chǔ)，導(dǎo)致頸周?chē)∪?、關(guān)節(jié)繼發(fā)性改變和相鄰椎體退變?cè)錾苯訅浩壬窠?jīng)血管所誘發(fā)與之相關(guān)的臨床癥狀和體征的疾病。后縱韌帶退變?cè)陬i椎病的發(fā)病因素中，占重要地位1、2。大量的研究表明頸椎后縱韌帶退變與基

3、因、環(huán)境等多種因素有關(guān)。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)椎間盤(pán)及黃韌帶的生物化學(xué)水平微量變化進(jìn)行了大量的研究，但對(duì)頸椎后縱韌帶膠原和蛋白多糖等物質(zhì)生物化學(xué)水平定量變化的相關(guān)研究鮮見(jiàn)3。    本實(shí)驗(yàn)通過(guò)定量測(cè)定實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組總膠原、型膠原、型膠原、蛋白多糖和鈣含量變化，同時(shí)對(duì)比觀察兩組顯微病理變化，為頸椎后縱韌帶退變提供分子生物化學(xué)量化依據(jù)，并探討頸椎后縱韌帶在頸椎病發(fā)病機(jī)理中的意義。   1  材料和方法1.1  病例選擇  病例組選取本院2005年10月2006年5月收治病人中的15例脊髓型頸椎病手術(shù)患者的C4、5或C5、6節(jié)段頸

4、椎后縱韌帶，并去除明顯骨化塊部分，其中男9例，女6例；年齡47歲63歲，平均年齡54歲，頸椎病均根據(jù)臨床癥狀、體征及常規(guī)X線、MRI檢查明確診斷；對(duì)照組由東南大學(xué)解剖教研室提供，為同年齡段10例生前無(wú)糖尿病史、頸肩痛病史、家族性頸椎病史尸體，C4、5和C5、6頸椎后縱韌帶作對(duì)照，其中男6例，女4例；年齡4560歲，平均52歲，在死亡后12 h內(nèi)取材。標(biāo)本取得后，用生理鹽水沖洗，吸水紙吸干表面的水分，鋁錫紙密封放入-80 冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?.2  主要試劑和儀器  標(biāo)準(zhǔn)羥脯氨酸（Sigma,USA）；酶標(biāo)器（Bio Red，USA）；型、型膠原酶聯(lián)免疫測(cè)定試劑盒（TPI Inc

5、，USA）；甲基百里香酚藍(lán)比色法鈣測(cè)定試劑盒（南京建成生物技術(shù)有限公司，中國(guó)）；Masson三色試劑盒（福建邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司，中國(guó)）。1.3  Woessner方法測(cè)定羥脯氨酸  標(biāo)本脫水、脫脂、烘干、稱重，加100倍于樣本量6 mol/L鹽酸在110 分解24 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器去除鹽酸，雙蒸水溶解殘留物，加氯胺T溶液室溫靜置20 min，加過(guò)氯酸溶液室溫靜置5 min，加對(duì)苯胺基苯甲醛溶液在60 溫箱20 min，取出待冷卻，在波長(zhǎng)560 nm處測(cè)定吸光值。通過(guò)羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)液內(nèi)的羥脯氨酸濃度，以此推算組織總膠原蛋白含量。1.4  ELISA測(cè)定型

6、膠原的含量  標(biāo)本稱重，脫水脫脂，0.4 mol乙酸浸泡過(guò)夜，在冰浴下制備成勻漿，以鹽析法提取膠原。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定型膠原，按試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行，在波長(zhǎng)450 nm下測(cè)定型膠原的濃度，計(jì)算含量。1.5  蛋白多糖含量測(cè)定方法  采用間苯三酚分光光度法4，測(cè)定光密度值，轉(zhuǎn)換為量值作蛋白多糖含量的測(cè)定。1.6  鈣含量測(cè)定  標(biāo)本烘干稱重，研磨成粉末，濃鹽酸高溫分解，蒸發(fā)鹽酸，雙蒸水溶解殘留物，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行甲基百里香酚藍(lán)比色法測(cè)定鈣離子含量。1.7  組織病理學(xué)觀察  標(biāo)本用10福爾馬林浸泡過(guò)夜，脫水、透明、

7、浸蠟、切片，Masson染色，光鏡觀察。1.8  統(tǒng)計(jì)方法  用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)總膠原、型膠原、型膠原、蛋白多糖和鈣比值的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果以x-±s表示，組間差異比較應(yīng)用兩組均數(shù)的t檢驗(yàn)。P0.05表示差異有意義。    2  結(jié)果2.1  標(biāo)本大體觀察  試驗(yàn)組后縱韌帶質(zhì)地變硬，彈性減低，色澤發(fā)白，有時(shí)可觸及質(zhì)地硬的骨化塊。對(duì)照組后縱韌帶質(zhì)地柔軟，富有彈性，有光澤，濕潤(rùn)。    2.2  Woessner方法測(cè)定羥脯氨酸結(jié)果（表1） &#

8、160;  表1  羥脯氨酸和總膠原含量測(cè)定（略）2.3  ELISA法測(cè)定型、型膠原含量及其比值（表2）表2  型和型膠原含量測(cè)定（mg/g）及型/型膠原比值（略）2.4  間苯三酚分光光度法測(cè)定蛋白多糖含量和甲基百里香酚藍(lán)比色法測(cè)定鈣離子含量（表3）表3  蛋白多糖和鈣含量（略）2.5  組織病理學(xué)觀察  Masson三色染色膠原纖維呈藍(lán)色，彈性纖維呈紅色。實(shí)驗(yàn)組鏡下出現(xiàn)較多的纖維變性區(qū)，彈性纖維減少，甚至呈灶狀缺失，膠原纖維增多，纖維腫脹，界限模糊，外形不規(guī)則，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，排列紊亂，細(xì)胞數(shù)較密（圖1、2）

9、。對(duì)照組光鏡下頸椎后縱韌帶主要由膠原纖維和彈力纖維組成，纖維呈波浪狀，排列規(guī)則，與韌帶縱軸一致。纖維間細(xì)胞稀疏，主要為纖維細(xì)胞，細(xì)胞成梭形，長(zhǎng)軸與纖維走向平行（圖3、4）。  圖1實(shí)驗(yàn)組HE染色（10×20）（略） 圖2實(shí)驗(yàn)組Masson三色染色（10×40）（略） 圖3對(duì)照組HE染色（10×20）（略） 圖4對(duì)照組Masson三色染色（10×40）（略）3  討論3.1  頸椎后縱韌帶的病理變化  后縱韌帶以膠原纖維及彈性纖維為主，膠原纖維使韌帶組織具有一定的強(qiáng)度和剛度，膠原蛋白含量

10、多少、纖維走行，以及韌帶的形狀尺寸、截面積，與載荷方向一致的纖維數(shù)目多少，纖維寬窄厚薄，決定后縱韌帶的強(qiáng)度5。頸椎后縱韌帶承擔(dān)著頸椎的張力載荷，有防止椎間盤(pán)后突出和限制脊柱過(guò)度前曲的作用，對(duì)頸椎穩(wěn)定性有重要作用6。隨著年齡增加，椎間盤(pán)退變，椎間隙變窄，椎間不穩(wěn)，椎間異?；顒?dòng)增加，相應(yīng)節(jié)段的后縱韌帶受到反復(fù)異常刺激。急慢性挫傷時(shí)后縱韌帶發(fā)生出血、炎性水腫等一系列病理變化，造成后縱韌帶腫脹肥厚，反復(fù)微小出血，血腫機(jī)化，甚至發(fā)展到軟骨化或骨化，并成為壓迫脊髓的因素之一。Ono等7通過(guò)病理研究顯示頸椎病患者頸椎后縱韌帶基質(zhì)纖維性和非纖維性組織增生。本組實(shí)驗(yàn)病理觀察顯示，與對(duì)照組相比較，病例組頸椎后縱韌

11、帶明顯發(fā)生退性變，其纖維之間的緊密聯(lián)系喪失，纖維排列紊亂，膠原纖維和彈性纖維網(wǎng)斷裂，纖維間隙增寬，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，呈玻璃樣變性，進(jìn)一步證明頸椎病患者的頸椎后縱韌帶退變。 3.2  頸椎后縱韌帶總膠原變化  羥脯氨酸可作為半定量測(cè)定總膠原的指標(biāo)。和黃韌帶、椎間盤(pán)等檢測(cè)結(jié)果不同的是8，本試驗(yàn)測(cè)得的結(jié)果顯示，病例組總膠原較對(duì)照組減少。退變的頸椎間盤(pán)內(nèi)處于高壓狀態(tài)9，椎體不穩(wěn)，致頸椎后縱韌帶長(zhǎng)期處于緊張狀態(tài)，纖維被拉伸，韌帶的血管受到擠壓，血液供應(yīng)減少，影響韌帶的代謝。缺血缺氧狀態(tài)，妨礙膠原的合成，妨礙組織的修復(fù)。據(jù)此，本研究推測(cè)椎間盤(pán)退變是致頸椎后縱韌帶膠原減少的重要原因之一。&

12、#160;   膠原纖維減少及其排列紊亂、斷裂，使后縱韌帶強(qiáng)度和剛度降低。這樣反過(guò)來(lái)改變?cè)蓄i椎生物力學(xué)的平衡6，加重頸椎不穩(wěn)，可見(jiàn)頸椎后縱韌帶退變對(duì)頸椎病起到惡性循環(huán)的作用。3.3  頸椎后縱韌帶、型膠原含量改變及型型膠原比值意義  型膠原存在于皮膚、韌帶、骨等組織中，型膠原蛋白為軟骨膠原,型膠原作為韌帶的支持物，賦予韌帶以張力；型膠原使韌帶更能承載抗壓應(yīng)力，二者的比值反應(yīng)出韌帶的抗張力性能及剛度8。型膠原的分泌與軟骨細(xì)胞及類(lèi)軟骨細(xì)胞相關(guān)，Yasui等10對(duì)正常和頸椎病后縱韌帶膠原分布進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)肥厚頸椎韌帶的基質(zhì)內(nèi)型膠原增加，型膠原主要包繞類(lèi)軟骨

13、細(xì)胞。本試驗(yàn)檢測(cè)到型膠原減少，型膠原增加，實(shí)驗(yàn)組型型膠原比值明顯低于對(duì)照組，提示頸椎后縱韌帶呈骨化傾向，進(jìn)一步提示頸椎后縱韌帶退變嚴(yán)重程度。    3.4  頸椎后縱韌帶蛋白多糖和鈣含量變化    蛋白多糖作為韌帶一種重要成分，分子中帶有大量的負(fù)電荷，產(chǎn)生一定的固定電荷密度，對(duì)水及陽(yáng)離子具有較大的親和力，其體積龐大，可為組織提供良好的水合空間，可維持后縱韌帶中的水分。蛋白多糖維持膠原纖維排列有序性，防止膠原纖維的降解。蛋白多糖聚合體還可阻止基質(zhì)的鈣化，使韌帶富有彈性。因此，蛋白多糖聚合體在維持后縱韌帶的生理功能及防止其退變方

14、面都起到重要的作用11。    頸椎后縱韌帶長(zhǎng)期處于高張力狀態(tài)是致蛋白多糖分解的重要因素之一，蛋白多糖聚合體的分解而引起水分的丟失。早期可以通過(guò)自身的修復(fù)重新組合成蛋白多糖聚合體；而當(dāng)組織發(fā)生變性時(shí)，這種修復(fù)過(guò)程往往不易進(jìn)行，最后導(dǎo)致后縱韌帶纖維化、骨化，加速后縱韌帶的變形、退變，后縱韌帶組織的黏彈性及對(duì)抗壓力減弱。本研究中試驗(yàn)組蛋白多糖較對(duì)照組明顯減少，為頸椎病患者頸椎后縱韌帶的退行性改變提供量化依據(jù)。    因退行性改變，蛋白多糖的分解，以及其他多種因素致使頸椎后縱韌帶鈣過(guò)多沉積12，引起后縱韌帶的骨化，試驗(yàn)組的鈣含量明顯高于對(duì)照

15、組，進(jìn)一步證明了此分子水平的變化。    綜上所述，頸椎間盤(pán)退變可促進(jìn)頸椎后縱韌帶的退變，退變的頸椎后縱韌帶內(nèi)膠原、蛋白多糖和鈣等含量成分的改變，韌帶骨化，韌帶失去原有的生物學(xué)特性，反過(guò)來(lái)加重了頸椎病。頸椎后縱韌帶在頸椎病的發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用，希望此試驗(yàn)的結(jié)果能為以后的臨床治療提供一些思路。   【參考文獻(xiàn)】  1 Sudo H,Taneichi H,Kaneda K.Secondary medulla oblongata involvement following middle cervical spinal cor

16、d injury associated with latent traumatic instability in a patient with ossification of the posterinr longitudinal LigamentJ.Spinal Cord,2006,44（2）:126?129.2 Wimberley DWi Vaccaro AR,Goyai N,et al.Acute quadriplegia following closed traction reduction of a cervical facet dislocation in the setting o

17、f ossification of the posterior longitudinal ligament:case reportJ.Spine,2005,30(15）:433?438.3 Inamasu I,Gulot BH,Sachs DC,et al.Ossification of the posterior longitudinal ligament:an update on its biology,epidemidiogy and natural historyJ.Neurosurgery,2006,58（6）:1027?1039.4 趙梓汝,吳小濤,祁亞斌,等.TGF?撥?1干預(yù)下

18、體內(nèi)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)退變椎間盤(pán)治療的實(shí)驗(yàn)研究J.中國(guó)矯形外科雜志,2006,14（13）:1019?1022.5 Victor H,Frankee Margarta Nordin,主編,戴?,王以進(jìn),周健男,等譯.骨骼系統(tǒng)的生物力學(xué)基礎(chǔ)M.上海:學(xué)林出版社,1985,89.6 Epstein N.Posterior approaches in the management of cervical spondylosis and ossification of the posterior longitudinal ligamentJ.Surg Neurol,2002,58（3、4）:194?207;discussion:207?208.7 Ono K,Yonenobu K,Miyamoto S,et al.Pathology of ossification of the posterior longitudinal ligament and ligamentum flavumJ.Clin Orthop Relat Res,1999,（359）