淺論GlcNAc糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)下調(diào)對(duì)tau蛋白磷酸化的影響

1、淺論GlcNAc糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)下調(diào)對(duì)tau蛋白磷酸化的影響 【摘要】 以人OGlcNAc糖基轉(zhuǎn)移酶（OGT）基因?yàn)榘悬c(diǎn)，研究小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）對(duì)HEK293T細(xì)胞中OGT基因表達(dá)的抑制作用，以及這種抑制作用對(duì)tau蛋白磷酸化與糖基化修飾的影響。方法： 根據(jù)人OGT基因序列特點(diǎn)，設(shè)計(jì)高效且特異性強(qiáng)的siRNA。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siRNA進(jìn)入HEK293T細(xì)胞，通過(guò)實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)siRNA對(duì)OGT基因表達(dá)的抑制。用蛋白免疫印跡法檢測(cè)tau蛋白糖基化與磷酸化修飾的變化。結(jié)果： 設(shè)計(jì)的siRNA能夠有效抑制OGT基因的表達(dá)，與空白組相比，抑制效率可達(dá)7

2、8.1%左右。OGT基因表達(dá)的下調(diào)使tau蛋白糖基化水平下降，而磷酸化水平增高。結(jié)論： tau蛋白的糖基化負(fù)調(diào)節(jié)其磷酸化,葡萄糖攝入減少或代謝降低可能在阿爾茨海默爾病的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。 【關(guān)鍵詞】 阿爾茨海默爾病 tau蛋白 OGlcNAc糖基轉(zhuǎn)移酶 RNA干擾 Abstract Objective: To investigate the inhibitory effect of small interference RNA(siRNA)targeting OGT gene on the alteration of tau phosphorylation and glycosylatio

3、n level in human being. Methods： The siRNANC and the siRNA targeting OGT gene were chemically synthesized and transfected into HEK293T cells via lipofectamine2000.Realtime PCR was employed to evaluate the efficacy of RNA interference. The level of tau phosphorylation and glycosylation were detected

4、by Western blot. Results： The designed siRNA could effectivly downregulate the OGT mRNA expression to 78.1% while compared with blank group. The level of the tau phosphorylation at various sites was significantly upregulated and the level of the tau glycosylation was downregulated with the inhibitio

5、n of OGT gene expression. Conclusion： The modification of phosphorylation and glycosylation of tau protein indicated the apparent negative correlation, which probably was induced by deficient brain glucose uptake/metabolism in Alzheimers disease Key words Alzheimers disease; tau; OGT; RNA interferin

6、g 阿爾茨海默爾病（Alzheimers disease, AD）的病理特征包括大腦局部尤其是海馬和皮層神經(jīng)元退行性病變，細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFT)和細(xì)胞外老年斑（senile plaque ,SP）沉積。其中NFT的數(shù)量和患者的癡呆程度呈明顯的正相關(guān)，被認(rèn)為是AD患者神經(jīng)原退化的病理基礎(chǔ)1,2。NFT的主要成分是由異常過(guò)度磷酸化tau蛋白聚集而形成的雙螺旋絲（paired helical filaments，PHFs）。過(guò)度磷酸化的tau蛋白除失去了其刺激和促進(jìn)微管組裝的功能外，還變成了毒性分子，可獵獲正常的微管相關(guān)蛋白，使得微管崩解，神經(jīng)

7、細(xì)胞退化，最終導(dǎo)致AD患者的認(rèn)知功能受到嚴(yán)重的損害。 蛋白質(zhì)的修飾方式主要有磷酸化、糖基化、泛素化、經(jīng)典糖基化、硝基化和OGlcNAc糖基化。其中蛋白質(zhì)OGlcNAc 糖基化是發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核內(nèi)的一種廣泛動(dòng)態(tài)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾現(xiàn)象。這種糖基化是單個(gè)N乙酰氨基葡萄糖(Nacetylglucosamine,GlcNAc)通過(guò)O糖苷鍵連接到絲氨酸或蘇氨酸(Ser/Thr)羥基上的。 在AD患者腦中，tau蛋白OGlcNAc糖基化水平明顯低于正常的老年人3。蛋白質(zhì)的OGlcNAc糖基化程度是OGlcNAc糖基轉(zhuǎn)移酶(OGT)和OGlcNAc糖苷酶（OGlcNAcase，OGA）共同作用的結(jié)果，OG

8、T的作用是催化GlcNAc連接到肽鏈的絲氨酸或蘇氨酸羥基上，UDPGlcNAc是它的供體底物，而OGA的作用是將GlcNAc從蛋白質(zhì)的羥基上去除。用OGlcNAc糖苷酶抑制劑處理體外培養(yǎng)的大鼠腦片和神經(jīng)細(xì)胞，以增加OGlcNAc糖基化的水平，則明顯抑制tau蛋白多個(gè)位點(diǎn)的磷酸化，提示tau的OGlcNAc糖基化與磷酸化呈明顯的負(fù)相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)RNA干擾的方法來(lái)降低HEK293T細(xì)胞內(nèi)OGT基因的表達(dá)水平，檢測(cè)tau蛋白多個(gè)位點(diǎn)磷酸化與糖基化的變化，從而證明以上的推測(cè)，為進(jìn)一步探討AD的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 1 材料與方法 1.1 材 料 1.1.1 細(xì)胞、培養(yǎng)基與質(zhì)粒 HEK293T細(xì)胞

9、株為本實(shí)驗(yàn)室保存。0.25% TrypsinEDTA，小牛血清，DMEM培養(yǎng)基，OptiMEM均為Invitrogen公司產(chǎn)品。pCI/tau441由日本物理化學(xué)研究所Takashima 教授惠贈(zèng)。pTG19T載體購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司。 1.1.2 siRNA、引物及抗體 siRNA為上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。陰性對(duì)照（siRNANC）及5端標(biāo)記了熒光素FAM的陰性對(duì)照（siRNANCFAM）購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。人OGT引物與內(nèi)參引物GAPDH由上海生物工程有限公司合成?？贵w：抗taupS396為美國(guó)Biosource Internatinal公司產(chǎn)品，RL2(Affin

10、ity Bioreagents, Golden, CO)用作OGlcNAc 糖基化的檢測(cè)，R134d(多克隆抗體,識(shí)別磷酸化和非磷酸化的tau蛋白)為美國(guó)紐約州立基礎(chǔ)研究所神經(jīng)化學(xué)系自行研制。辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG為美國(guó)Jackson Immuno Reseach Laboratories產(chǎn)品。 1.1.3 其他材料 WizardTM Plus Miniprep System (Promega), SYBR Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)試劑盒(Takara),WizardSV Gel and PCR CleanUp System (Promega

11、公司)。Trizol試劑,LipofectamineTM 2000（Invitrogen公司）,First Strand cDNA Synthesis Kit(MBI)。PCR Kit(上海生工)，BioTraceTM PVDF (Pall公司)。ECL顯色試劑盒(Pierce公司)。質(zhì)粒抽提試劑盒：PureYieldTM Plasmid Midiprep System (Promega公司)。1.2 方 法 1.2.1 siRNA及引物的合成 根據(jù)Elbashir和Reynolds的siRNA設(shè)計(jì)原則結(jié)合siDirect在線設(shè)計(jì)系統(tǒng)設(shè)計(jì)、選取了1對(duì)siRNA 序列。OGTsiRNA： 正義鏈

12、5GAAGAAAGUUCGUGGCAAAdTdT3；陰性對(duì)照序列正義鏈 : 5UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT3 。每1OD干粉狀siRNA加入150 l的DEPC水即為20 mol/L的工作液。 1.2.2 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及抽提 pCI/tau441按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)細(xì)胞, 在克隆并鑒定后大量擴(kuò)增。用Promega公司質(zhì)粒中抽試劑盒抽提質(zhì)粒（根據(jù)說(shuō)明書步驟操作）。測(cè)定D (260 nm)以確定質(zhì)粒DNA 濃度，-20 儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 HEK293T細(xì)胞接種于含10小牛血清的DMEM培養(yǎng)基（高糖），置37，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)到8090融

13、合度，胰酶消化，接種于12孔板中。轉(zhuǎn)染分空白對(duì)照組(對(duì)細(xì)胞不做任何處理)，轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組(加入與實(shí)驗(yàn)組等量的轉(zhuǎn)染試劑，Mock組)，陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA,siRNANC 組)及實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染OGTsiRNA)，同時(shí)轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照FAM進(jìn)行轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)，轉(zhuǎn)染嚴(yán)格按照LipofectamineTM 2000試劑盒說(shuō)明操作。 1.2.4 實(shí)時(shí)PCR分析 標(biāo)準(zhǔn)品制備：從HEK293T細(xì)胞中抽提總RNA(按Trizol說(shuō)明書操作)，反轉(zhuǎn)錄成cDNA(按Fermentas說(shuō)明操作)，PCR擴(kuò)增OGT和GAPDH片段。人OGT上游引物：5CGGGCTATCGAACTACAACCA3 ，下游：5CC

14、CATATTAGAGTAGGCATCAGCAAAG3(356 bp)；內(nèi)參引物GAPDH上游：5ACCACAGTCCATGCCATCAC3；下游：5TCCACCACCCTGTTGCTGTA3(452 bp)。OGT基因擴(kuò)增與GAPDH基因一樣，在0.2 ml離心管中進(jìn)行：依次加入17.25 l ddH2O，2.0 l cDNA模板，2.50 l 10PCR 緩沖液，1.50 l MgCl2(25 mmol/L)，2.50 l dNTPmix(2.00 mmol/L)，0.50 l上游引物(10 mol/L)，0.50 l下游引物(10 mol/L)，0.25 l Taq DNA聚合酶(2 U/

15、l)。將上述混合液輕輕混勻，稍加離心：94，5 min94，40 s58 ，40 s72 ，35 s 30 個(gè)循環(huán)； 72，7 min; 4 。擴(kuò)增完成行1%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收PCR產(chǎn)物，與載體pTG19 T 連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5大腸埃希菌，藍(lán)白斑篩選得到陽(yáng)性克隆，挑取陽(yáng)性克隆過(guò)夜培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒后交上海生物工程有限公司測(cè)序并進(jìn)一步通過(guò)酶切鑒定確認(rèn)結(jié)果。測(cè)定抽提質(zhì)粒的濃度，以10倍梯度稀釋制作標(biāo)準(zhǔn)品，-40 保存。轉(zhuǎn)染結(jié)束后24 h提取總RNA，紫外分光光度儀測(cè)定D(260 nm)D(280 nm)光密值比值。計(jì)算RNA含量，每個(gè)樣本取2 g反轉(zhuǎn)錄為cDNA(方法同上)。 實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)

16、：將上述合成的cDNA模板與pTG19OGT及pTG19GAPDH一同擴(kuò)增, 10l SYBRPremix Ex TaqTM(2)，0.4 l PCR 上游引物(10 mol/L)， 0.4 l PCR 下游引物(10 mol/L)，2 l cDNA模板，7.2 l ddH2O。擴(kuò)增程序：95 10 s ,95 5 s ,58 15 s , 72 20 s ,循環(huán)30次。在退火階段收集熒光信號(hào)。用Rotor Gene3000熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀附帶的分析軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量分析。OGT基因表達(dá)的計(jì)算方法：以同一份標(biāo)本OGT拷貝數(shù)/GAPDH拷貝數(shù)表示OGT基因的表達(dá)水平，并設(shè)對(duì)照組OGT拷貝數(shù)/

17、GAPDH拷貝數(shù)為1，將各樣本拷貝數(shù)比值標(biāo)準(zhǔn)化, 定義為N OGT (標(biāo)準(zhǔn)化的OGT表達(dá)水平)，并以此值作圖。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，所得結(jié)果間比較采用單因素方差分析。 1.2.5 Western Blot分析 HEK293T細(xì)胞接種于12孔板, 分組同上。細(xì)胞生長(zhǎng)至50融合度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。因?yàn)镠EK293T細(xì)胞內(nèi)無(wú)tau蛋白表達(dá)，所以在轉(zhuǎn)染siRNA的同時(shí),每孔還將共轉(zhuǎn)染1.2 g的質(zhì)粒pCI/tau441。48 h后吸干凈培養(yǎng)基，用溫的及預(yù)冷的PBS液各洗1遍，加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液50 mmol/L TrisHCl(pH 7.4)，8.5%蔗糖，50 mmol/L NaF，1 mmol/L Na3VO

18、4，0.1% Triton100，2 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF，10 g/ml aprotinin，10 g/ml Leupeptin，10 g/ml pepstain，100 mmol/L OGlcNAc，冰上孵育15 min, 收集每孔細(xì)胞至1.5 ml的EP管內(nèi)，沸水中煮5 min，4，12 000g離心15 min。取上清，用改良Folin酚法測(cè)量蛋白濃度。蛋白印跡分析按文獻(xiàn)3所述方法完成。 1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。各實(shí)驗(yàn)組比較用單因素方差分析，P0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2 結(jié) 果 2.1 HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染

19、效率檢測(cè) 用siRNANCFAM轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，24 h后，倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染了siRNANCFAM的細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，轉(zhuǎn)染效率約為85%，見(jiàn)圖1。轉(zhuǎn)染效率計(jì)算：轉(zhuǎn)染效率=熒光陽(yáng)性細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù)。 2.2 OGTsiRNA對(duì)OGT基因mRNA水平影響 采用濃度為100 nmol/L的siRNA轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示, OGTsiRNA片段可有效地降低HEK293T細(xì)胞中OGT的表達(dá)水平，與空白對(duì)照組相比沉默效果可達(dá)78.1%左右，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。而Mock組，siRNANC組與對(duì)照組相比，OGT表達(dá)無(wú)明顯下降，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見(jiàn)

20、圖2。 2.3 Tau蛋白糖基化與磷酸化修飾的變化 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，Western blot檢測(cè)總tau蛋白（磷酸化與非磷酸化的tau蛋白）及tau蛋白糖基化與磷酸化修飾的變化。以肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參，結(jié)果以目的基因內(nèi)參灰度值表示。結(jié)果顯示各組間總tau蛋白(R134d)沒(méi)有明顯的變化，而實(shí)驗(yàn)組tau蛋白的糖基化水平（RL2）明顯減少。與此同時(shí)tau蛋白ser396（pS396）磷酸化水平明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。各對(duì)照組之間無(wú)明顯差異（圖3）。 3 討 論 有文獻(xiàn)報(bào)道，在AD患者腦中葡萄糖攝入和代謝明顯降低4,5，并且認(rèn)為是葡萄糖攝入和利用的降低引起神經(jīng)細(xì)胞退化，而不是由于神

21、經(jīng)細(xì)胞退化引起葡萄糖攝入和利用的降低6。葡萄糖攝入和代謝降低使需要葡萄糖作為原料的UDP乙酰氨基己糖的合成減少，造成UDPGlcNAc的顯著下降，而UDPGlcNAc又是OGlcNAc糖基化的供體，最終導(dǎo)致AD患者腦中蛋白質(zhì)OGlcNAc糖基化修飾數(shù)量減少。Tau蛋白同樣受OGlcNAc糖基化的修飾。越來(lái)越多的證據(jù)表明： tau蛋白的OGlcNAc糖基化與磷酸化呈明顯的負(fù)相關(guān)，而且這兩種修飾之間可能存在一種平衡機(jī)制7。用饑餓處理小鼠，使小鼠腦內(nèi)葡萄糖攝入減少,引起小鼠大腦皮質(zhì)中總tau蛋白和tau蛋白的OGlcNAc 糖基化水平降低，tau蛋白磷酸化水平升高。并且饑餓引起的tau蛋白OGlcN

22、Ac糖基化和磷酸化改變均在恢復(fù)進(jìn)食后逆轉(zhuǎn)成正常水平8，說(shuō)明葡萄糖攝入和代謝降低在AD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起關(guān)鍵作用。 RNAi是新近發(fā)現(xiàn)的一種由雙鏈RNA引發(fā)的特異性高效基因表達(dá)抑制途徑。與傳統(tǒng)的反義核苷酸技術(shù)相比較，RNAi能更高效、更特異地抑制靶基因的表達(dá) 9。我們根據(jù)OGT基因序列的特點(diǎn)設(shè)計(jì)了高效且特異性強(qiáng)的OGTsiRNA干擾片段。我們選取HEK293T細(xì)胞作為研究對(duì)象，因該細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率高，且由于沒(méi)有內(nèi)源性tau蛋白的表達(dá)，可通過(guò)外源tau質(zhì)粒的轉(zhuǎn)入，直接觀察tau蛋白表達(dá)狀況。用熒光標(biāo)記的FAM陰性對(duì)照檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后轉(zhuǎn)染效率可達(dá)約85%。轉(zhuǎn)染結(jié)束24小時(shí)后通過(guò)實(shí)時(shí)

23、PCR檢測(cè)OGT基因mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)OGTsiRNA對(duì)OGT基因的沉默效率可達(dá)78.1%。轉(zhuǎn)染結(jié)束48小時(shí)后，用Western blot檢測(cè)tau蛋白糖基化與磷酸化修飾的變化，總的tau蛋白(磷酸化與非磷酸化的tau蛋白)沒(méi)有明顯的變化,而tau蛋白的糖基化水平明顯減少, tau蛋白的ser396位點(diǎn)磷酸化水平(pS396)顯著增高。ser396位于tau蛋白的C末端，它的磷酸化與tau蛋白的成纖維作用有密切關(guān)系10，還可能直接導(dǎo)致tau蛋白聚集形成PHFs，影響tau蛋白正常功能。 我們的實(shí)驗(yàn)用RNAi的方法干擾OGT基因的表達(dá)，致使tau蛋白的糖基化修飾減少而磷酸化修飾顯著增高。結(jié)果

24、證明tau蛋白的糖基化負(fù)調(diào)節(jié)其磷酸化,葡萄糖攝入減少或代謝降低可能在AD的發(fā)病過(guò)程中起關(guān)鍵的作用。本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)tau蛋白Ser396位點(diǎn)的磷酸化進(jìn)行了研究，我們還將對(duì) 1 Arriagada PV, Growdon JH, HedleyWhyte ET, et al. Neurofibrillary tangles but not senile plaques parallel duration and severity of Alzheimers diseaseJ. Neurology,1992, 42:631-639. 2 Riley KP, Snowdon DA, Markesbery WR. Alzheimers neurofibrillary pathology and the spectrum of cognitive function: findings from the Nun StudyJ. Ann Neurol, 2002, 51(5): 567-577. 3 Liu F, Iqbal K, GrundkeIqbal I, et al. OGlcNAcylation regulates phosphorylation of tau: a mechanism involve