基因工程習(xí)題及參考答案02

1、基因工程習(xí)題及參考答案02工具酶部分限制性?xún)?nèi)切核酸酶一、填空題1嚴(yán)格地說(shuō)限制性?xún)?nèi)切核酸酶(restriction endonuclease)是指已被證明是 的酶?；蚬こ讨邪涯切┚哂凶R(shí)別 的內(nèi)切核酸酶統(tǒng)稱(chēng)為限制性?xún)?nèi)切核酸酶。2 年Luria 和Human 在T 偶數(shù)噬菌體對(duì)大腸桿菌感染實(shí)驗(yàn)中首次發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌的 現(xiàn)象。31970 年，Smith 和Wilcox 從流感嗜血桿菌中分離到一種限制酶，能夠特異性的切割DNA，這個(gè)酶后來(lái)被命名為 ，這是第一個(gè)分離到的類(lèi)限制性?xún)?nèi)切核酸酶。4通過(guò)比較用不同組合的限制性?xún)?nèi)切核酸酶處理某一特定基因區(qū)域所得到的不同大小的片段，可以構(gòu)建顯示該區(qū)域各限制性?xún)?nèi)切核酸酶切點(diǎn)

2、相互位置的 。5類(lèi)限制性?xún)?nèi)切核酸酶分子量較小一般在2040kDa，通常由 亞基所組成。它們的作用底物為雙鏈DNA，極少數(shù)類(lèi)酶也可作用于單鏈DNA，或DNARNA 雜合雙鏈。這類(lèi)酶的專(zhuān)一性強(qiáng)，它不僅對(duì)酶切點(diǎn)鄰近的兩個(gè)堿基有嚴(yán)格要求，而且對(duì)更遠(yuǎn)的堿基也有要求，因此，類(lèi)酶既具有 專(zhuān)一性，也具有 專(zhuān)一性，一般在識(shí)別序列內(nèi)切割。切割的方式有 ，產(chǎn)生 末端的DNA 片段或 的DNA片段。作用時(shí)需要 作輔助因子，但不需要 和 。6完全的回文序列具有兩個(gè)基本的特點(diǎn)，就是：(1) (2) 。7類(lèi)限制性?xún)?nèi)切核酸酶一般識(shí)別 個(gè)堿基，也有識(shí)別多序列的限制性?xún)?nèi)切核酸酶。根據(jù)對(duì)限制性?xún)?nèi)切核酸酶識(shí)別序列的分析， 限制性?xún)?nèi)切

3、核酸酶識(shí)別序列具有傾向，即它們?cè)谧R(shí)別序列中含量較高。8EcoK 是I 類(lèi)限制性?xún)?nèi)切核酸酶，分子組成是2 2 ，分子量300kDa。在這些亞基中，亞基具有 作用；亞基具有 的活性；亞基的作用則是 。9個(gè)體之間DNA 限制性片段長(zhǎng)度的差異叫 。10限制性?xún)?nèi)切核酸酶是按屬名和種名相結(jié)合的原則命名的，第一個(gè)大寫(xiě)字母取自 ，第二、第三兩個(gè)字母取自 ，第四個(gè)字母則用 表示。11限制性?xún)?nèi)切核酸酶Acy I 識(shí)別的序列是5GRCGYG-3，其中R ，Y 。12在酶切反應(yīng)管加完各種反應(yīng)物后，需要離心2 秒鐘，其目的是 和 。13部分酶切可采取的措施有：(1) (2) (3) 等。14第一個(gè)分離的限制性?xún)?nèi)切核酸酶

4、是 ；而第一個(gè)用于構(gòu)建重組體的限制性?xún)?nèi)切核酸酶是 。15限制性?xún)?nèi)切核酸酶BsuRI 和Hae的來(lái)源不同，但識(shí)別的序列都是 ，它們屬于 。16由于DNA 是由4 種堿基組成的，所以任何限制性?xún)?nèi)切核酸酶的切割頻率的理論值應(yīng)該是 。17Sal I 和Not I 都是哺乳動(dòng)物中識(shí)別序列稀有的酶，在哺乳動(dòng)物基因組的5kb 片段中，找到NotI 切點(diǎn)的概率是 。18部分酶切是指控制反應(yīng)條件，使得酶在DNA 序列上的識(shí)別位點(diǎn)只有部分得到切割，它的理論依據(jù)是 。19I 類(lèi)限制酶識(shí)別DNA 的位點(diǎn)和切割的DNA 位點(diǎn)是不同的，切割位點(diǎn)的識(shí)別結(jié)合有兩種模型，一種是 ，另一種是 。20限制性?xún)?nèi)切核酸酶通常保存在 濃

5、度的甘油溶液中。二、判斷題（ ）1限制與修飾現(xiàn)象是宿主的一種保護(hù)體系，它是通過(guò)對(duì)外源DNA 的修飾和對(duì)自身DNA的限制實(shí)現(xiàn)的。（ ）2限制性?xún)?nèi)切核酸酶在DNA 中的識(shí)別切割位點(diǎn)的二級(jí)三級(jí)結(jié)構(gòu)也影響酶切效率。一般來(lái)說(shuō)，完全切割質(zhì)?；虿《綝NA，要比切割線狀DNA 需要更多的酶，最高的需要20 倍。（ ）3如果限制性?xún)?nèi)切核酸酶的識(shí)別位點(diǎn)位于DNA 分子的末端，那么接近末端的程度也影響切割，如Hpa和MboI 要求識(shí)別序列之前至少有一個(gè)堿基對(duì)存在才能切割。（ ）4能夠產(chǎn)生防御病毒侵染的限制性?xún)?nèi)切核酸酶的細(xì)菌，其本身的基因組中沒(méi)有被該核酸酶識(shí)別的序列。（ ）5限制性圖譜與限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP

6、)圖譜的最顯著的區(qū)別在于前者是一個(gè)物理圖譜而后者是一個(gè)連鎖圖。（ ）6用限制性?xún)?nèi)切核酸酶Hae分別切割載體DNA 和供體DNA 后，可用Ecoli DNA 連接酶進(jìn)行連接。 ，（ ）7已知某一內(nèi)切核酸酶在一環(huán)狀DNA 上有3 個(gè)切點(diǎn)，因此，用此酶切割該環(huán)狀DNA,可得到3 個(gè)片段。（ ）8迄今所發(fā)現(xiàn)的限制性?xún)?nèi)切核酸酶既能作用于雙鏈DNA，又能作用于單鏈DNA。（ ）9基因工程中使用的類(lèi)限制性?xún)?nèi)切核酸酶不僅有內(nèi)切核酸酶的活性，而且有甲基化酶的活性。（ ）10DNA 多態(tài)性就是限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性。（ ）11用限制性?xún)?nèi)切核酸酶PstI 切割質(zhì)粒pBR322 后，再用外切核酸酶Exo進(jìn)行系列缺失，可

7、得到一系列大小不同的缺失突變體。（ ）12甘油會(huì)使許多限制性?xún)?nèi)切核酸酶的特異性發(fā)生改變，是導(dǎo)致一些酶的星活性的主要原因之一，防止的辦法是在酶切反應(yīng)體系中，將甘油的濃度控制在5以下。（ ）13具有EcoR末端的外源片段只能以一個(gè)方向插入到EcoR末端的載體中。（ ）14從Esherichiacoli K 中分離的限制性?xún)?nèi)切核酸酶命名為EcoK。（ ）15同一種限制性?xún)?nèi)切核酸酶切割靶DNA，得到的片段的兩個(gè)末端都是相同的。（ ）16在限制與修飾系統(tǒng)中，修飾主要是甲基化作用，一旦位點(diǎn)被甲基化了，其他的限制性酶就不能切割了。（ ）17稀有酶是指那些識(shí)別序列很長(zhǎng)又不常用的限制性?xún)?nèi)切核酸酶。三、選擇題(單

8、選或多選)1關(guān)于宿主控制的限制修飾現(xiàn)象的本質(zhì)，下列描述中只有( )不太恰當(dāng)。(a)由作用于同一DNA 序列的兩種酶構(gòu)成(b)這一系統(tǒng)中的核酸酶都是類(lèi)限制性?xún)?nèi)切核酸酶(c)這一系統(tǒng)中的修飾酶主要是通過(guò)甲基化作用對(duì)DNA 進(jìn)行修飾(d)不同的宿主系統(tǒng)具有不同的限制修飾系統(tǒng)2RFLP 產(chǎn)生自( )(a)使用不同的限制性?xún)?nèi)切核酸酶(b)每種類(lèi)型的染色體有兩條(二倍體)(c)染色體中堿基的隨機(jī)變化(d)Southern 印跡(e)不同探針的使用3型限制性?xún)?nèi)切核酸酶： ( )(a)有內(nèi)切核酸酶和甲基化酶活性且經(jīng)常識(shí)別回文序列(b)僅有內(nèi)切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一種酶提供(c)限制性識(shí)別非甲基化的核

9、苷酸序列(d)有外切核酸酶和甲基化酶活性(e)僅有外切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一種酶提供4型限制性?xún)?nèi)切核酸酶： ( )(a)由兩個(gè)亞基組成，僅識(shí)別半甲基化位點(diǎn)。甲基化位點(diǎn)相對(duì)于限制位點(diǎn)的位置(上游或下游)決定了DNA 是被甲基化還是被限制(b)不同亞基的識(shí)別位點(diǎn)甲基化和限制活性相互排斥：MS 亞基促使甲基化，R 亞基促使限制(c)由兩個(gè)亞基組成，在識(shí)別位點(diǎn)附近識(shí)別并進(jìn)行甲基化或限制(d)在錯(cuò)配修復(fù)中起關(guān)鍵作用，因?yàn)槊附Y(jié)合到DNA 上是以結(jié)構(gòu)扭曲為基礎(chǔ)而不是序列錯(cuò)誤識(shí)別(e)是光依賴(lài)型酶，是嘧啶二聚體進(jìn)行“光反應(yīng)”的關(guān)鍵酶，它們能使胸腺嘧啶二聚體間的共價(jià)鍵斷裂5分析限制性?xún)?nèi)切核酸酶切割雙鏈

10、DNA 所得到的DNA 片段的長(zhǎng)度有助于物理作圖，這是因?yàn)椋? )(a)即使只用一種限制酶，因?yàn)镈NA 是線性的，所以也可以迅速確定限制性片段序列(b)內(nèi)切酶在等距離位點(diǎn)切割DNA，同時(shí)對(duì)于每個(gè)生物體的長(zhǎng)度是特異的(c)DNA 的線性意味著單限制性酶切片段的長(zhǎng)度之和等于DNA 的總長(zhǎng)，而雙酶切產(chǎn)生的重疊片段則產(chǎn)生模糊的圖譜(d)這些內(nèi)切酶的消化活性是物種特異的(e)這一技術(shù)同時(shí)為核苷酸序列提供了廣泛信息6通過(guò)限制性片段分析，可以對(duì)等位基因進(jìn)行精確的分析比較，其原因是：( )(a)限制性?xún)?nèi)切核酸酶只切割兩個(gè)變異等位基因中的一個(gè)(b)它利用限制性位點(diǎn)作為遺傳標(biāo)記(c)一個(gè)特定細(xì)胞中等位基因的核苷酸

11、序列不會(huì)是相同的(d)它不依賴(lài)于變異等位基因產(chǎn)物的功能。(e)限制性?xún)?nèi)切核酸酶的切點(diǎn)被限制在DNA 的編碼區(qū)域內(nèi)7限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)是：( )(a)用于遺傳的“指紋結(jié)構(gòu)”模式分析的技術(shù)(b)二倍體細(xì)胞中的兩個(gè)等位基因限制性圖譜的差別(c)物種中的兩個(gè)個(gè)體限制性圖譜間的差別(d)兩種物種個(gè)體間的限制性圖譜差別(e)兩種酶在單個(gè)染色體上限制性圖譜的差別 ·8為了正確地構(gòu)建一個(gè)真核基因組的物理圖譜：( )。(a)必須有可能清晰地分離各個(gè)染色體(通過(guò)脈沖場(chǎng)凝膠電泳)(b)必須從單倍體細(xì)胞(配子)中分離DNA，這樣避免了由二倍體細(xì)胞中同源染色體的存在而產(chǎn)生的干擾信息(c)必須進(jìn)行

12、單個(gè)染色體分析，這只能在細(xì)胞分裂后期進(jìn)行(d)必須找到對(duì)于每個(gè)染色體只切割一次的限制酶(e)必須首先分離核DNA 和細(xì)胞器DNA，然后對(duì)它們分別作圖9下面有關(guān)限制酶的敘述哪些是正確的?( )(a)限制酶是外切酶而不是內(nèi)切酶(b)限制酶在特異序列(識(shí)別位點(diǎn))對(duì)DNA 進(jìn)行切割(c)同一種限制酶切割DNA 時(shí)留下的末端序列總是相同的(d)一些限制酶在識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)稍有不同的點(diǎn)切割雙鏈DNA，產(chǎn)生黏末端(e)一些限制酶在識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)相同的位置切割雙鏈DNA，產(chǎn)生平末端10因研究噬菌體的限制與修飾現(xiàn)象的本質(zhì)而獲得諾貝爾獎(jiǎng)的科學(xué)家是：( )(a) JLederberg (b) WArber (c) HSmit

13、h (d) FSanger11第一個(gè)被分離的類(lèi)酶是： ( )(a)EcoK (b)Hind (c)Hind (d)EcoB12雙鏈DNA 中一段自我互補(bǔ)的序列被稱(chēng)為回文序列，這種序列一般具有下列特征： ( )(a)有對(duì)稱(chēng)軸 (b)兩條鏈的5 3方向的序列相同(c)是類(lèi)酶的識(shí)別序列 (d)可增強(qiáng)基因的表達(dá)13在下列進(jìn)行DNA 部分酶切的條件中，控制那一項(xiàng)最好?( )(a)反應(yīng)時(shí)間 (b)酶量(c)反應(yīng)體積 (d)酶反應(yīng)的溫度14在下列試劑中，那一種可以螯合Ca2離子?( )(a)EDTA (b)檸檬酸鈉 (c)SDS (d)EGTA ，15在下列工具酶中，那一種可以被EGTA 抑制活性?( )(

14、a)S1 單鏈核酸酶 (b)末端轉(zhuǎn)移酶 (c)堿性磷酸酶 (d)Bal 31 核酸酶16限制性?xún)?nèi)切核酸酶可以特異性地識(shí)別： ( )(a)雙鏈DNA 的特定堿基對(duì) (b)雙鏈DNA 的特定堿基序列(c)特定的三聯(lián)密碼 (d)以上都正確17在下列酶中，催化反應(yīng)不需要ATP 的是( )(a)EcoK (b)EcoB (c)T4DNA 連接酶 (d)BamHl18下列關(guān)于限制性?xún)?nèi)切核酸酶的表示方法中，正確一項(xiàng)的是( )。(a)Sau3AI (b)EcoRI (c)hindIII (d)Sau 3A119限制性?xún)?nèi)切核酸酶的星號(hào)活性是指：( )(a)在非常規(guī)條件下，識(shí)別和切割序列發(fā)生變化的活性。(b)活性

15、大大提高(c)切割速度大大加快(d)識(shí)別序列與原來(lái)的完全不同20下面哪一種不是產(chǎn)生星號(hào)活性的主要原因?( )(a)甘油含量過(guò)高 (b)反應(yīng)體系中含有有機(jī)溶劑(c)含有非Mg2的二價(jià)陽(yáng)離子 (d)酶切反應(yīng)時(shí)酶濃度過(guò)低21DNA 被某種酶切割后，電泳得到的電泳帶有些擴(kuò)散，下列原因中，那一項(xiàng)不太可能?( )(a)酶失活 (b)蛋白質(zhì)(如BSA)同DNA 結(jié)合(c)酶_切條件不合適 (d)有外切核酸酶污染22關(guān)于回文序列，下列各項(xiàng)中，( )是不正確的(a)是限制性?xún)?nèi)切核酸酶的識(shí)別序列 (b)是某些蛋白的識(shí)別序列(c)是基因的旁側(cè)序列 (d)是高度重復(fù)序列23關(guān)于宿主控制的限制修飾現(xiàn)象的本質(zhì)，下列描述中

16、只有( )不太恰當(dāng)(a)由作用于同一DNA 序列的兩種酶構(gòu)成(b)這一系統(tǒng)中的核酸酶都是類(lèi)限制性?xún)?nèi)切核酸酶(c)這一系統(tǒng)中的修飾酶主要是通過(guò)甲基化作用對(duì)DNA 進(jìn)行修飾(d)不同的宿主系統(tǒng)具有不同的限制修飾系統(tǒng)四、簡(jiǎn)答題1現(xiàn)分離到X82 噬菌體的一個(gè)突變型，它同野生型的噬菌斑相當(dāng)不同，并已分離到這兩種噬菌體的DNA，請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)，初步鑒定是點(diǎn)突變、插入突變還是缺失突變?2說(shuō)明SangerDNA 測(cè)序法的原理。3在酶切反應(yīng)緩沖液中加入BSA 的目的是什么?機(jī)理是什么?4Fredrick 和McClarin 等用一個(gè)由13 個(gè)堿基對(duì)的DNA 片段與EcoRI、反應(yīng)，然后分離到酶和DNA 共結(jié)晶的

17、復(fù)合物，通過(guò)X 射線分析發(fā)現(xiàn)了什么?5有些噬菌體和質(zhì)粒常常編碼一些抗限制性酶的蛋白以中和宿主的限制系統(tǒng)。你認(rèn)為噬菌體和質(zhì)粒還有哪些可能的方式避免宿主的限制作用?6某學(xué)生在用EcoRI 切割外源DNA 片段時(shí)，出現(xiàn)了星號(hào)活性，請(qǐng)分析可能的原因?7在序列5CGAACATATGGAGT-3中含有一個(gè)6bp 的類(lèi)限制性?xún)?nèi)切核酸酶的識(shí)別序列，該位點(diǎn)的序列可能是什么?8下面幾種序列中你認(rèn)為哪一個(gè)(哪些)最有可能是類(lèi)酶的識(shí)別序列：GAATCG，AAATTT， GATATC， ACGGCA?為什么?9用連接酶將Sau 3AI(,bGATC)切割的DNA 與經(jīng)BamHI(G 'GATCC)切割的DNA

18、連接起來(lái)后，能夠被BamHI 切割的機(jī)率有多大(用百分比表示)?10用Klenow 酶填補(bǔ)的辦法可使5黏性末端轉(zhuǎn)變成平末端。這種方法常使DNA 上的某些限制酶的識(shí)別位點(diǎn)消失。請(qǐng)問(wèn)，對(duì)于下列限制酶，用這種方法處理會(huì)不會(huì)使它們的識(shí)別序列都消失?BamH I(G GATCC)；Taq I(T CGA)，BssH(G CGCGC)。11請(qǐng)推測(cè)細(xì)菌的染色體上是否會(huì)有編碼識(shí)別8 個(gè)堿基的內(nèi)切酶? 怎樣驗(yàn)證?12當(dāng)兩種限制性?xún)?nèi)切核酸酶的作用條件不同時(shí)，若要進(jìn)行雙酶切，應(yīng)采取什么措施?為什么?五、問(wèn)答題1 什么是細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)(restriction-modificationsystem，R-Msyste

19、m)2 細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)有什么意義?3 說(shuō)明限制性?xún)?nèi)切核酸酶的命名原則要點(diǎn)。4 I 類(lèi)限制酶具有哪些特點(diǎn)?在基因工程中有什么作用?5 類(lèi)限制酶有哪些特點(diǎn)?6 何謂限制性?xún)?nèi)切核酸酶的切割頻率?7 什么是限制性?xún)?nèi)切核酸酶的星號(hào)活性?受哪些因素影響?8 雙酶消化法(doubledigests)繪制限制性?xún)?nèi)切核酸酶酶譜的原理。9 什么是DNA 多態(tài)性(DNApolymorphism)?10限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)。11計(jì)算下列三種酶各自在某染色體DNA 序列上識(shí)別位點(diǎn)間的平均距離：Alu I： 5AGCT 3”， E

20、coR I： 5GAATTC 3 3，TCGA 5 3CTTAGG 5Acy I： 5GPuCGPyC 3 3CPyGCPuG 5(注： Py 二任何一種嘧啶：Pu 二任何一種嘌吟)12在細(xì)菌質(zhì)粒pBPI 的四環(huán)素抗性基因tetR 的中間有一個(gè)Hind的切點(diǎn)。用Hind 切割果蠅基因組DNA，以pBPl 為載體構(gòu)建基因組文庫(kù)。分子雜交證明克隆15 帶有果蠅的目的基因。用Hind 和EcoRV 對(duì)克隆15 進(jìn)行了酶切分析，電泳結(jié)果如圖下圖(用酶切的pBPl 質(zhì)粒DNA 作對(duì)照)，旁邊標(biāo)出了片段的大小。圖 酶切電泳圖譜12： Hind切割；34：EcoRV 切割；56：HindIII+EcoRV；

21、1、3、5 是質(zhì)粒DNA；2、4、6 是15 號(hào)克隆。(1)繪制含有插入片段和不含插入片段時(shí)的pBPl 的限制性圖譜，并標(biāo)明四環(huán)素抗性基因的位置；(2)如果用克隆在另一個(gè)與pBPl 完全不同源載體上的四環(huán)素抗性基因作為探針進(jìn)行Southern 印跡雜交，預(yù)測(cè)上述電泳圖會(huì)出現(xiàn)什么樣的雜交帶?(3)如果用克隆15 的果蠅DNA 片段作為探針進(jìn)行Southern 印跡雜交，放射自顯影的結(jié)果又是如何?13為什么大多數(shù)內(nèi)切酶被稱(chēng)為“限制”酶。14據(jù)Science 雜志報(bào)道：一種重要的遺傳疾病可由導(dǎo)致DNA 中堿基替換的誘變劑在體外進(jìn)行人工誘導(dǎo)。設(shè)計(jì)一種快速用以鑒定疾病基因型的檢測(cè)方法。15為了繪制長(zhǎng)為3

22、0kb BamH限制性片段的限制性圖譜，分別用EcoRI、Hpa、EcoRI+Hpa消化這一片段的三個(gè)樣品，然后通過(guò)凝膠電泳分離DNA 片段，溴化乙錠染色后觀察DNA 帶型(見(jiàn)下圖)。請(qǐng)根據(jù)這些結(jié)果，繪制一個(gè)限制性圖譜，要標(biāo)明EcoRI和Hpa識(shí)別位點(diǎn)間的相對(duì)位置，以及它們之間的距離(kb)。圖 用EcoRI、Hpa單獨(dú)切割及用這兩種酶混合切割片斷產(chǎn)生的DNA帶六、概念題1回文結(jié)構(gòu) 2同裂酶 3限制性物理圖譜工具酶-限制性?xún)?nèi)切核酸酶(參考答案)一、填空題1限制修飾系統(tǒng)的一個(gè)組成部分；雙鏈DNA 分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA 雙鏈結(jié)構(gòu)21952； 限制和修飾3Hind4限制性酶切

23、圖譜524 個(gè)相同的；切割位點(diǎn)；識(shí)別位點(diǎn)的；平切和交錯(cuò)切；平；具有突出黏睦末端；Mg2+；ATP；SAM6(1)能夠在中間劃一個(gè)對(duì)稱(chēng)軸，兩側(cè)的序列兩兩對(duì)稱(chēng)互補(bǔ)配對(duì)；(2)兩條互補(bǔ)鏈的5 3的序列組成相同，即將一條鏈旋轉(zhuǎn)180°，則兩條鏈重疊746；GC8限制性?xún)?nèi)切核酸酶的作用； 甲基化酶；識(shí)別DNA9限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)10屬名的第一個(gè)字母；種名的前兩個(gè)字母；株名11代表A 或者是T；代表G 或者C12混合均勻；防止部分酶切13(1)減少酶量；(2)縮短反應(yīng)時(shí)間；(3)增大反應(yīng)體積14EcoK；EcoRl15GGCC；異源同工酶16 4n17120018酶切速度是不均衡的

24、 19限制酶移動(dòng)；DNA 彎曲20 50二、判斷題1 錯(cuò)誤。 對(duì)外源DNA 的限制，對(duì)自身DNA 的修飾。2 正確。3 正確。4 錯(cuò)誤。細(xì)菌本身基因組中核酸酶的識(shí)別序列因C 或A 殘基的甲基化作用而受到保護(hù)，可免遭切割。5 正確。6 錯(cuò)誤。限制性?xún)?nèi)切核酸酶Hae切割DNA 產(chǎn)生平末端的DNA 片段，EcoliDNA 連接酶不能連接平末端。7 正確。8 錯(cuò)誤。9 錯(cuò)誤。類(lèi)限制性?xún)?nèi)切核酸酶沒(méi)有甲基化酶的活性。10錯(cuò)誤。DNA 多態(tài)性是指中性突變不低于1的一種群體，一般是不能檢測(cè)的。如果這種突變發(fā)生在限制性?xún)?nèi)切核酸酶的識(shí)別位點(diǎn)上，就會(huì)改變酶切的模式，可以通過(guò)電泳檢測(cè)出來(lái)。所以，RFLP 是DNA 多

25、態(tài)性的一部分。11錯(cuò)誤。限制性?xún)?nèi)切核酸酶PstI 切割DNA 后產(chǎn)生3，突出的黏性末端，而外切核酸酶Exo只能從突出的5，端降解DNA。12正確。13正確。14錯(cuò)誤。應(yīng)是EcoK。15錯(cuò)誤。同一種限制性?xún)?nèi)切核酸酶切割靶DNA，得到的片段的兩個(gè)末端不一定相同。如果識(shí)別序列不是完整的回文序列，產(chǎn)生的末端就不相同。16錯(cuò)誤。限制與修飾是一對(duì)保護(hù)系統(tǒng)，修飾了就不能被同一系統(tǒng)中的限制性?xún)?nèi)切核酸酶切割，但是對(duì)不同限制修飾系統(tǒng)中的酶沒(méi)有作用。17錯(cuò)誤。在某種生物基因組DNA 中切割頻率很低的酶稱(chēng)為稀有酶。三、選擇題(單選或多選)1b； 2C； 3b； 4C； 5C；6b，d； 7c； 8a，e； 9b，c，

26、d，e； 10b；11c； 12a，b，c； 13b； 14d； 15D 16b； 17d； 18d； 19a； 20d；21a； 22d； 23b四、簡(jiǎn)答題1 答：用RFLP 分析法。2答：SangerDNA 測(cè)序法是建立在兩個(gè)基本原理之上：(1)核酸是依賴(lài)于模板在聚合酶的作用下由5，端向3，端聚合(DNA 聚合酶參與了細(xì)菌修復(fù)DNA 合成過(guò)程)；(2)可延伸的引物必須能提供游離的3，羥基末端，雙脫氧核苷酸由于缺少游離的3，羥基末端，因此會(huì)終止聚合反應(yīng)的進(jìn)行。如果分別用4 種雙脫氧核苷酸終止反應(yīng)，則會(huì)獲得4 組長(zhǎng)度不同的DNA 片段。通過(guò)比較所有DNA 片段的長(zhǎng)度可以得知核苷酸的序列。3答：

27、目的是保護(hù)酶活性，機(jī)理是通過(guò)提高溶液中蛋白質(zhì)的濃度，防止酶失活。4答：發(fā)現(xiàn)：具有活性的EcoRI 是一個(gè)二聚體，它們同DNA 結(jié)合形成一個(gè)直徑為50A 的球形結(jié)構(gòu)，兩個(gè)EcoRI 位于DNA 的兩側(cè)。5答：某些噬菌體的基因組中有修飾的堿基，因此對(duì)限制性?xún)?nèi)切核酸酶具有免疫作用。另一種避免限制酶切割的途徑是抑制SAMase 的活性，該酶制造S腺苷甲硫氨酸。某些限制酶作用時(shí)需要S腺苷甲硫氨酸。然而，噬菌體在發(fā)育過(guò)程中不能同某些單碳的供體反應(yīng)。6答：鹽離子濃度不對(duì)，溫度不對(duì)，甘油濃度過(guò)高。7答：回文序列是：5-CATATG-38答：GATATC；AAATUF，因?yàn)樗鼈兪腔匚男蛄小?答：25。10答：B

28、ssH不會(huì)。11答：關(guān)于這個(gè)問(wèn)題沒(méi)有明確的答案。這些酶的作用不僅僅限于噬菌體的感染，因?yàn)榇蠖鄶?shù)噬菌體并不含有8 個(gè)堿基序列的酶切位點(diǎn)，一種可能是8 個(gè)堿基的酶是質(zhì)粒整合后加上去的，作為質(zhì)粒附加系統(tǒng)的一部分。12答：注意星活性，先低鹽，后高鹽；先低溫酶，后高溫酶；并且可以直接在換酶前將第一種酶失活，再加第二種酶，否則，易產(chǎn)生星活性。或使用通用緩沖液。五、問(wèn)答題1答：細(xì)菌中有作用于同一DNA 的兩種酶，即分解DNA 的限制酶和改變DNA 堿基結(jié)構(gòu)使其免遭限制酶分解的修飾酶。 而且，這兩種酶作用于同一DNA 的相同部位，把這兩種酶所組成的系統(tǒng)稱(chēng)為限制與修飾系統(tǒng)。2答：不同種的細(xì)菌或不同的細(xì)菌菌株具有

29、不同的限制酶和修飾酶組成的限制與修飾系統(tǒng)。修飾的本質(zhì)是通過(guò)甲基化酶將DNA 中某些堿基進(jìn)行甲基化修飾，由于宿主自身DNA 上的這些位點(diǎn)進(jìn)行了修飾，限制酶就不能進(jìn)行切割。由于外來(lái)的DNA 在相應(yīng)的堿基上沒(méi)有被甲基化，宿主的限制酶通過(guò)對(duì)該位點(diǎn)的識(shí)別來(lái)分辨敵我，并將人侵的外來(lái)DNA 分子降解掉。所以DNA 限制作用和修飾作用為細(xì)胞提供了保護(hù)。3答：限制性?xún)?nèi)切核酸酶采用三字母的命名原則，即屬名+種名+株名的各一個(gè)首字母，再加上序號(hào)。基本原則： 34 個(gè)字母組成，方式是：屬名+種名+株名+序號(hào)；首字母： 取屬名的第一個(gè)字母，且斜體大寫(xiě)；第二字母： 取種名的第一個(gè)字母，斜體小寫(xiě)；第三字母： (1)取種名的

30、第二個(gè)字母，斜體小寫(xiě)；(2)若種名有詞頭，且已命名過(guò)限制酶壩，j 取詞頭后的第一字母代替。第四字母： 若有株名，株名則作為第四字母，是否大小寫(xiě)，根據(jù)原來(lái)的情況而定，但用正體。順序號(hào)： 若在同一菌株中分離了幾種限制酶，則按先后順序冠以I、等，用正體。4答：I 類(lèi)限制性?xún)?nèi)切核酸酶的分子量較大，一般在30 萬(wàn)道爾頓以上，通常由三個(gè)不同的亞基所組成。例如限制性?xún)?nèi)切核酸酶EcoB 是由R(135kDa)，M(62kDa)和S(55kDa) 三種亞基組成的復(fù)合酶，這三個(gè)亞基分別由不同的基因編碼。全酶的總分子量為449kDa，共5個(gè)亞基，其中R 亞基和M 亞基各兩分子。I 類(lèi)酶不僅是一種內(nèi)切核酸酶，同時(shí)在酶

31、分子上還具有甲基化酶和ATPase 的活性，所以是具有多種酶活性的復(fù)合酶類(lèi)。作用時(shí)除了需要Mg2+作輔助因子外，還要求ATP 和S腺苷甲硫氨酸(SAM)的存在。I 類(lèi)酶具有特異的識(shí)別序列，大約15 個(gè)堿基對(duì)。I 類(lèi)酶雖然能夠在一定序列上識(shí)別DNA 分子，并能同DNA 分子作用，因其識(shí)別DNA 后，要朝一個(gè)方向或兩個(gè)方向移動(dòng)一段距離(通常為1000 個(gè)堿基左右)，并且要形成一個(gè)環(huán)才能切割DNA，所以識(shí)別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)不一致，產(chǎn)生的片段較大。因此在基因工程中作用不大。5答：類(lèi)酶是基因工程中不常用的酶，分子量和亞基組成類(lèi)似于I 類(lèi)酶，作用方式基本同類(lèi)酶。如EcoPI 是由兩個(gè)亞基組成，一個(gè)亞基(M

32、亞基)負(fù)責(zé)位點(diǎn)識(shí)別和修飾，另一個(gè)亞基(R 亞基)具有核酸酶的活性。切割DNA 時(shí)需要ATP、Mg2+，也能被SAM激活，但并非必須。6答：切割頻率是指限制性?xún)?nèi)切核酸酶在某DNA 分子中預(yù)測(cè)的切點(diǎn)數(shù)。由于DNA 是由4 種類(lèi)型的單核苷酸組成，假定DNA 的堿基組成是均一的，而限制性?xún)?nèi)切核酸酶的識(shí)別位點(diǎn)是隨機(jī)分布的，那么對(duì)于任何一種限制酶的切割頻率，理論上應(yīng)為14n，n 表示該限制酶識(shí)別的堿基數(shù)。如識(shí)別4 個(gè)堿基的限制酶，其切割頻率應(yīng)為每256 個(gè)堿基有一個(gè)識(shí)別序列和切點(diǎn)(144=1256)，識(shí)別5 個(gè)堿基的限制性?xún)?nèi)切核酸酶，其切割頻率應(yīng)為每1024 個(gè)堿基有一個(gè)識(shí)別序列和切點(diǎn)，余類(lèi)推。7答：類(lèi)限

33、制酶雖然識(shí)別和切割的序列都具有特異性，但是這種特異性受特定條件的限制，即在一定環(huán)境條件下表現(xiàn)出來(lái)的特異性。條件的改變，限制酶的特異性就會(huì)松動(dòng)，識(shí)別的序列和切割都有一些改變，改變后的活性通常稱(chēng)第二活性，而將這種因條件的改變會(huì)出現(xiàn)第二活性的酶的右上角加一個(gè)星號(hào)表示，因此第二活性又稱(chēng)為星活性。概括起來(lái)，誘發(fā)星活性的因素有如下幾種：(1)高甘油含量5，vv)；(2)限制性?xún)?nèi)切核酸酶用量過(guò)高(>100Ug DNA)；(3)低離子強(qiáng)度(<25 mmolL)；(4)高pH(8.0 以上)；(5)含有有機(jī)溶劑，如DMSO，乙醇等；(6)有非Mg2+的二價(jià)陽(yáng)離子存在(如Mn2+，Cu2+，C02+，

34、Zn2+等)。8答：雙酶消化法是繪制DNA 中兩個(gè)或兩個(gè)以上限制性?xún)?nèi)切核酸酶圖譜所采用的方法。做法是在兩個(gè)限制性?xún)?nèi)切核酸酶分別單獨(dú)消化DNA 分子的基礎(chǔ)上，然后再用這兩個(gè)酶同時(shí)或先后消化此DNA，根據(jù)它們的結(jié)果，構(gòu)建物理圖譜。 ，9答：在正常人群中，各個(gè)體DNA 分子的某些位點(diǎn)可以發(fā)生中性改變，這些改變雖然會(huì)使DNA 一級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定變化，但不影響基因的表達(dá)，如果這種中性突變?cè)谌巳褐械念l率不低于1，這一現(xiàn)象被稱(chēng)為多態(tài)性。DNA 多態(tài)性本質(zhì)上是染色體DNA 中核苷酸數(shù)目或排列順序的個(gè)體差異，這些差異多數(shù)為中性突變，不引起表型改變。10答：當(dāng)DNA 序列的差異發(fā)生在限制性?xún)?nèi)切核酸酶的識(shí)別位點(diǎn)時(shí)，或當(dāng)DNA 片段的插入、缺失或重復(fù)導(dǎo)致基因組DNA 經(jīng)限制性?xún)?nèi)切核酸酶酶解后，其片段長(zhǎng)度的改變可以經(jīng)凝膠電泳區(qū)分時(shí)，DNA 多態(tài)性就可應(yīng)用限制性?xún)?nèi)切核酸酶進(jìn)行分析，這種多態(tài)性稱(chēng)為限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)。11 答 AluI：(14)4=1256； EcoRI： (14)6=14096 AcyI：(14)4(12)2=1102412 答：(1) 酶切圖譜示于下圖圖 限制性圖譜(2)除No.2 的2.5kb，No.6 的1