類(lèi)高血糖素多肽-2對(duì)大鼠梗阻性黃疸小腸上皮細(xì)胞緊密連接的調(diào)控

1、類(lèi)高血糖素多肽-2對(duì)大鼠梗阻性黃疸小腸上皮細(xì)胞緊密連接的調(diào)控 10-09-03 16:15:00 編輯：studa20 作者：陳振勇馮賢松楊鵬周有生 【摘要】 目的：探討類(lèi)高血糖素多肽-2（glucagon-like peptide-2，GLP-2）對(duì)梗阻性黃疸小腸上皮細(xì)胞緊密連接的調(diào)控機(jī)制。方法：建立梗阻性黃疸大鼠模型，于造模后10 d，將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)A、B組，另設(shè)正常進(jìn)食大鼠作為正常組，每組10只。對(duì)照組給予0.01 mmol/L的PBS 0.5 mL，A組給予250 g/（kgd）、實(shí)驗(yàn)B組給予125 g/（kgd）的GLP-2溶液0.5 mL皮下注射，2次/d，連續(xù)7 d后

2、處死。取末端回腸黏膜組織，采用免疫組織化學(xué)及Western blots檢測(cè)緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1和Claudin -4的分布和表達(dá)，并利用圖像分析系統(tǒng)對(duì)Western blots圖像進(jìn)行定量分析。結(jié)果：梗阻性黃疸時(shí)ZO-1和Occludin分布不均，染色變淡，線條模糊，邊緣粗糙有毛刺狀突起。補(bǔ)充外源性GLP-2后，A組的ZO-1、Occludin和Claudin-1染色有所恢復(fù)，且強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)例數(shù)分別由對(duì)照組的2、3、2例升至A組的8、9、8例，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均 0.05）；Claudin-4表達(dá)和分布變化不明顯。而B(niǎo)組對(duì)緊密連接蛋白沒(méi)有影響。Weste

3、rn blot圖像定量分析得到相同的結(jié)果。結(jié)論：梗阻性黃疸時(shí)補(bǔ)充外源性GLP-2，能夠影響小腸黏膜上皮緊密連接蛋白的分布和表達(dá)，可以恢復(fù)腸黏膜上皮屏障的完整性。 【關(guān)鍵詞】 黃疸類(lèi)高血糖素多肽-2連接蛋白類(lèi)大鼠, Wistar 【ABSTRACT】 Objective: To study the effects of GLP-2 on intestinal mucosa epithelium tight junction in obstructive jaundice rats. Methods: The obstructive jaundice model of rats were set

4、up. Rats were randomly divided into 3 groups after 10 days operation alone. Ten rats were included in each group, and 0.5mL 0.01 mmol/L PBS for control group, 0.5mL 250 g.kg-1.d-1 GLP-2 for experiment group A, 0.5mL 125g.kg-1.d-1 GLP-2 for experiment group B , abdomen subcutaneous injectied, b.i.d7d

5、s. Normal group, supplied common foods, were established. Immunohistochemistry and Western-blot were used to examine the distribution and expression of tight junction proteins ZO-1,Occludin and Claudin-1, -4 in the terminal ileum mucosas. Image analytical system and statistics software were used to

6、analyze the results quantitatively. Results: In control group , ZO-1 and Occludin staining appeared discontinuous and vague ,with sentus enation at the outer enterocyte periphery. Exogenous supplied GLP-2, ZO-1、Occludin and Claudin-1 staining recovered somewhat in experiment group A. The numbers of

7、strong positive express were obviously higher in experiment group A than those in the control group （2vs8，3 vs9 ，2 vs 8, all P 0.05）. The distribution and expression of Claudin-4 altered unobviously. There were no noticeable changes on the expression and quantity of tight junction proteins in experi

8、ment group B. The same outcomes were obtained by quantitative analyzing Western blot images. Conclusion: Exogenous supplemented GLP-2 in obstructive jaundice, the quantity and distribution of the tight junction proteins ZO-1, Oc 梗阻性黃疸時(shí)小腸上皮細(xì)胞的通透性增加，腸黏膜屏障發(fā)生改變1。盡管目前不少方法可以恢復(fù)腸黏膜屏障，但也有許多未知之處。類(lèi)高血糖素多肽-2（glu

9、cagon-like peptide-2，GLP-2）作為一種腸道特異性生長(zhǎng)調(diào)控因子，可以促進(jìn)正常腸黏膜的生長(zhǎng)和受損腸黏膜的修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立梗阻性黃疸動(dòng)物模型，研究補(bǔ)充外源性GLP-2對(duì)腸上皮緊密連接蛋白成分的影響，探討GLP-2保護(hù)腸黏膜屏障的機(jī)制。 1材料與方法 1. 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型建立健康Wistar大鼠40只，雌雄不限，體質(zhì)量250330 g，由同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。30只大鼠術(shù)前禁食16l8 h，采用10水合氯醛（0.3 g/kg）腹腔注射麻醉，開(kāi)腹結(jié)扎并切斷膽總管，建立梗阻性黃疸動(dòng)物模型。術(shù)后4 h起自由飲用混合糖鹽水，24 h后開(kāi)始給予標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料并添加廣譜抗生素。術(shù)

10、后10 d隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)A組、實(shí)驗(yàn)B組和對(duì)照組，每組各10只。術(shù)后1016 d內(nèi)，對(duì)照組接受腹部皮下注射0.01 mmol/L PBS 0.5 mL，A組腹部皮下注射GLP-2液250 g/（kgd），B組注射GLP-2液125 g/（kgd），均為2次/d，連續(xù)7 d，第17天放血處死大鼠。在距回盲部10 cm處環(huán)形切取小腸組織。取1 mm1 mm1 mm小塊組織，于40 g/L甲醛中固定，進(jìn)行HE染色，石蠟包埋切片。同時(shí)取部分組織冰凍備用。另10只正常進(jìn)食大鼠為正常組，不參與建模，同期取材備用。 1.2主要試劑與儀器GLP-2的PBS溶液由美國(guó)多肽公司生產(chǎn)，單克隆兔抗ZO-1抗體、Occlu

11、din抗體，購(gòu)自美國(guó)Zymed Laboratories公司，四甲基異硫酸羅丹明（TRITC）-山羊抗兔IgG由北京中山生物技術(shù)有限公司提供，TranswellTM聚碳酸酯膜和聚乙烯膜均為美國(guó)Costar公司產(chǎn)品。SP免疫組織化學(xué)染色試劑盒、即用型免疫組織化學(xué)ElivisionTM plus廣譜試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)公司， -actin為武漢博士德產(chǎn)品，OLYMPUS BX41圖像采集系統(tǒng)產(chǎn)地美國(guó)。 1.3檢測(cè)指標(biāo)和判定方法采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)各組小腸組織ZO-1、Occludin、Claudin-1和Claudin-4蛋白的表達(dá)。常規(guī)SP法測(cè)定后DAB顯色，實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行

12、，陰性對(duì)照用PBS液代替一抗，同法進(jìn)行染色。反應(yīng)終濃度抗ZO-1為1200，Occludin抗體為1200， Claudin-1和Claudin -4抗體均為1800。選取染色清晰者切片58張，于低倍光鏡（200）下隨機(jī)選取3個(gè)視野，在高倍光鏡（1 000）下觀察細(xì)胞內(nèi)陽(yáng)性顆粒的分布。染色結(jié)果判定：由兩個(gè)獨(dú)立的觀察者進(jìn)行染色評(píng)分。細(xì)胞中出現(xiàn)棕褐色顆粒為陽(yáng)性。染色細(xì)胞數(shù)量50%判為強(qiáng)陽(yáng)性（），50%判為弱陽(yáng)性或陰性（+-）。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。 應(yīng)用Western blots分析各組小腸組織ZO-1、Occludin、C1audin-l和Claudin-4蛋白含量。取黏膜組織100 mg，加入1

13、 mL裂解液（20 mmol/L Tris-HCl，pH=7.5，1% Triton X-100，5 mmol/L EGTA，1 mmol/L Na3VO4， 1 mmo/L PMSF） 和10 mL緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl，pH=7.5，150 mmol/L NaCl， 1% Triton X-100，0.1% SDS，1 mmol/L脫氧膽酸鈉，2 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF），組織粉碎，勻漿，冰浴30 min；4 離心，取上清液，采用BCA法用紫外可見(jiàn)分光光度儀測(cè)定蛋白濃度，并用蒸餾水將各樣本統(tǒng)一稀釋為5106 g/L，-70 保存。各取樣本1

14、0 L及5 L的預(yù)染Marker，加入上樣緩沖液，混合后100 煮沸蛋白變性5 min，分別經(jīng)7.5和12SDS-PAGE凝膠電泳分離1 h或2 h，電轉(zhuǎn)30 min，轉(zhuǎn)移硝酸纖維膜至染色液中染色1 min，用含5脫脂奶粉的TBS-T（20 mmol/L Tris-HCl，pH=7.2，150 mmol/L NaCl，0.1%Tween 20）洗膜數(shù)次。浸入封閉液中封閉1 h。分別加一抗ZO-1、Occludin、Claudin-1和 Claudin-4抗體，11 000稀釋?zhuān)灰?actin為內(nèi)參，12 000稀釋?zhuān)? 孵育過(guò)夜。加入12 000的二抗TRITC-山羊抗兔IgG，室溫下孵育1

15、h。將硝酸纖維膜放入顯色液中，振蕩孵育510 min，暗室下膠片顯影，掃描。以-actin蛋白進(jìn)樣對(duì)照。采用Adobe Photoshop 軟件定量測(cè)量平均吸光度（OD）值。 1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用CLIS 醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件V1.0進(jìn)行分析。組內(nèi)多樣本計(jì)量資料用Fisher確切概率檢驗(yàn)；樣本均數(shù)的組間比較采用精確概率q檢驗(yàn)。P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2結(jié)果 2.1小腸黏膜4種蛋白的免疫組織化學(xué)檢測(cè) 2.1.1ZO-1蛋白和Occludin蛋白的表達(dá)光鏡下觀察正常組ZO-1均勻一致地連續(xù)分布于小腸上皮細(xì)胞的邊緣、細(xì)胞膜頂端，呈蜂巢狀，沿絨毛下方均勻連續(xù)分布，其中7例染色為強(qiáng)陽(yáng)性；對(duì)照組ZO-1蛋白分布不均，染色變淡，線條模糊，邊緣粗糙有毛刺狀突起，2例染色為強(qiáng)陽(yáng)性，與正常組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.03）；實(shí)驗(yàn)A、B組ZO