DNA提取方法和試劑作用詳解

1、1試劑的作用氯仿的作用？氯仿：克服酚的缺點；加速有機(jī)相與液相分層。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的跡量酚。（酚易溶于氯仿中）用酚-氯仿抽提細(xì)胞基因組DNA時，通常要在酚-氯仿中加少許異戊醇，為什么？異戊醇：減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡。異戊醇可以降低表面張力，從而減少氣泡產(chǎn)生。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。用乙醇沉淀DNA時，為什么加入單價的陽離子？用乙醇沉淀DNA時，通常要在溶液中加入單價的陽離子，如NaCl 或 NaAc，Na+中和DNA分子上的負(fù)電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，而易于聚集沉淀。2 DNA提取

2、分為三個基本步驟每個步驟的具體方法可根據(jù)樣品種類、影響提取的物質(zhì)以及后續(xù)步驟的不同而有區(qū)別。.細(xì)胞的破碎細(xì)菌有堅硬的細(xì)胞壁，首先要破碎經(jīng)胞。方法有三種;機(jī)械方法：超聲波處理法、研磨法、勻漿法;化學(xué)試劑法：用SDS處理細(xì)胞;酶解法：加入溶菌酶或蝸牛酶，都可使細(xì)胞壁破碎。利用研磨或者超聲破碎細(xì)胞，并通過加入去污劑以除掉膜脂。 加入蛋白酶，醋酸鹽沉淀，或者酚/氯仿抽提，以除掉細(xì)胞內(nèi)的蛋白，如與DNA結(jié)合的組蛋白。 將DNA在冷乙醇或異丙醇中沉淀，因為DNA在醇中不可溶而黏在一起，這一步也能除掉鹽分。 另外，目前也有利用吸附過柱的方法提取DNA的商業(yè)化試劑盒。  DNA提取的幾種方

3、法(1).濃鹽法A. 利用RNA和DNA在電解溶液中溶解度不同，將二者分離，常用的方法是用1M 氯納抽提,得到的DNA粘液與含有少量蛋白質(zhì) 氯仿一起搖蕩,使乳化,再離心除去蛋白質(zhì),此時蛋白質(zhì)凝膠停留在水相及氯仿相中間，而DNA位于上層水相中,用2倍體積95%乙醇可將DNA 鈉鹽沉淀出來.B. 也可用0.15 MNaCL液反復(fù)洗滌細(xì)胞破碎液除去RNA,再以1MNaCL提取脫氧核糖蛋白,再按氯仿-異醇法除去蛋白.兩種方法比較,后種方法使核酸降解可能少一些.C.以稀鹽酸溶液提取DNA 時,加入適量去污劑,如SDS可有助于蛋白質(zhì)與DNA 的分離。在提取過程中為抑制組織中的DNase對DNA 的降解作用

4、,在氯化鈉溶液中加入檸檬酸鈉作為金屬離子的烙合劑.通常用.15MNaCL,0.015M檸檬鈉,并稱SSC溶液,提取DNA. （2）.陰離子去污劑法; 用SDS或二甲苯酸鈉等去污劑使蛋白質(zhì)變性,可以直接從生物材料中提取DNA .由于細(xì)胞中DNA與蛋白質(zhì)之間常借靜電引力或配位鍵結(jié)合,因為陰離子去污劑能夠破壞這種價鍵,所以常用陰離子去污劑提取DNA（3）.苯酚抽提法：苯酚作為蛋白變性劑,同時抑制了DNase的降解作用.用苯酚處理勻漿液時,由于蛋白與DNA 聯(lián)結(jié)鍵已斷,蛋白分子表面又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。離心分層后取出水層，多次重復(fù)操作，再合并含DNA 的

5、水相，利用核酸不溶于醇的性質(zhì)，用乙醇沉淀DNA 。此時DNA是十分粘稠的物質(zhì)，可用玻璃漫漫繞成一團(tuán)，取出。此法的特點是使提取的DNA保持天然狀態(tài) （4）.水抽提法:利用核酸溶解于水的性質(zhì),將組織細(xì)胞破碎后,用低鹽溶液除去RNA，然后將沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中,離心后收集上清液.在上清中加入固體氯化鈉調(diào)節(jié)至2.6M.加入2倍體積95%乙醇,立即用攪拌法攪出.然后分別用66% ，80%和95%乙醇以及丙銅洗滌,最后在空氣中干燥,既得DNA樣品.此法提取的DNA中蛋白質(zhì)含量較高,故一般不用.為除蛋白可將此法加以改良,在提取過程中加入SDS. 1.動物來源的DNA的提取1. 1經(jīng)典提取方法

6、酚抽提法 、異丙醇沉淀法以及甲酞胺裂解法是提取DNA最為經(jīng)典的方法，目前很多方法的改進(jìn)都是在這些方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，這三種方法均利用蛋白酶K和十二烷基硫酸鈉(SDS)消化破碎細(xì)胞。在前兩種方法中裂解液先用酚/氯仿去除蛋白質(zhì)，再分別用乙醇或異丙醇沉淀DNA。甲酞胺法是利用高濃度的甲酞胺解聚蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合，然后利用透析來處理DNA樣品。這些經(jīng)典方法獲得的DNA純度很高，能夠滿足各種試驗的要求，但操作繁瑣，用時長，且所用試劑具有一定的毒性。1.2 玻璃棒纏繞法該 法 用 鹽酸肌裂解細(xì)胞，然后將細(xì)胞裂解物小心鋪在離心管中的乙醇上，用一個帶鉤的或前端為U形的玻璃棒在這兩層液體的交界面慢慢攪動，沉淀

7、出的膠狀DNA纏繞在玻璃棒上。玻璃棒上的DNA經(jīng)多次乙醇浸泡并于室溫下蒸干乙醇，由膠狀逐漸回縮，然后浸人TE中過夜，使其重新吸水膨脹進(jìn)而和玻璃棒分離。這種方法對操作技術(shù)要求較高，但簡單快速。1.3 血細(xì)胞DNA的快速提取法采用 非離子變性劑NP40(乙基苯基聚乙二醇)代替SDS裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞核，然后用酚/氯仿抽提DNA。這樣從血液中分離獲得的DNA純度高，能夠滿足各種臨床檢驗和實驗的需要。也可采用NP40和Tween -20同時作用破碎細(xì)胞膜，以避免SDS對以后步驟的負(fù)面作用。 Ba sun i等 采用了4種常用的從血液中提取DNA的方法:High Pure Viral Nucleic 試

8、劑盒法、QlAamp試劑盒法、Tri- PureTM試劑分離提取法以及經(jīng)典酚抽提法，對通常作拋棄處理的血凝塊進(jìn)行人DNA 及病毒DNA的抽提，發(fā)現(xiàn)前兩種方法可以迅速高效獲得目的DNA，從而建立了由血凝塊中提取DNA的方法，擴(kuò)大了臨床檢驗樣本的來源。1. 4 玻璃顆粒吸附法在該 法 中首先利用含異硫氰酸肌的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，然后加人含有能夠與DNA 結(jié)合的玻璃顆粒的緩沖液，經(jīng)沉淀收集結(jié)合染色體DNA的玻璃顆粒，利用洗脫液進(jìn)行洗脫獲得DNA。不僅玻璃顆?？梢耘cDNA 進(jìn)行結(jié)合，一定大小的硅膠顆粒也可以與 DNA進(jìn)行結(jié)合，據(jù)此，不少實驗工作者實踐了很多利用顆粒結(jié)合DNA 的提取方法。 Pichle

9、r等2在從抹香鯨(Physeter macrocephalus) 牙齒及骨骼中抽提DNA時采用了一種以二氧化硅為吸附介質(zhì)的方法，從抹香鯨標(biāo)本骨骼組織中鉆取的少量粉末中獲得了足夠用于分析的DNA產(chǎn)物，此方法擴(kuò)大了對稀有哺乳動物DNA研究的取材范圍。 Caldarelli-stefano等3在從福爾馬林固定、石蠟包埋的人體組織標(biāo)本中提取DNA時利用小磁珠作為結(jié)合核，也獲得了理想的純化 DNA。很多試劑公司也依此設(shè)計生產(chǎn)了許多顆粒提取試劑盒，Pint。等4就探討了采用 Gibc。公司的GlassMAX系統(tǒng)，對福爾馬林固定的組織進(jìn)行DNA提取的具體操作方法，目前這些試劑盒在臨床上廣為應(yīng)用，省時省力。1

10、.5 三乙醇胺月桂基硫酸鹽(TLS)法由于 常 規(guī) 方法中使用的蛋白酶K的水解條件不好掌握，采用TLS來提取組織、細(xì)胞以及外周血DNA可以克服這一弊端。 TLS是一種較強(qiáng)的表面活性劑，將其直接作用于細(xì)胞或組織勻漿，可迅速溶解細(xì)胞膜、核膜，而且蛋白質(zhì)與其結(jié)合后即失去對DNA 的結(jié)合，進(jìn)一步的純化可采用常規(guī)方法。1. 6 臨床病理標(biāo)本的DNA提取方法由于 PC R技術(shù)不僅可用于基因分離、核酸序列分析，還可用于突變體和重組體的構(gòu)建、基因表達(dá)調(diào)控研究、基因病的診斷及腫瘤發(fā)生機(jī)理的探討等。近年來，PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于病理學(xué)研究，尤其對福爾馬林固定石蠟包埋病理標(biāo)本進(jìn)行相關(guān)的研究更成為關(guān)注的焦點。對于從這

11、些病理標(biāo)本中提取 DNA的方法研究也很多。一般采用酚/氯仿抽提法，該法雖然效率較高，但費時費力，而且其操作中要求多次離心，增加了樣品污染的可能性。近年來很多高效靈敏的方法在實踐中得以采用，這些方法通常采用加熱或微波法s去除包埋的石蠟，使用Sephadex G- 5。柱色譜或鹽析法s7等去除蛋白質(zhì)。高文濤71等在研究福爾馬林固定石蠟包埋組織 DNA提取方法對PCR的影響時，發(fā)現(xiàn)在組織切片中加人鰲合樹脂(Chelating Resin，亞氨基二乙酸)提取獲得的DNA可取得較好的PCR擴(kuò)增結(jié)果。Coombs等s則采用熱循環(huán)方法，將標(biāo)本上的蠟融人樣品溶液，在酶的作用下進(jìn)行裂解，然后用Chelex-10

12、0進(jìn)行吸附，離心去蠟，這種方法安全、簡便、有效、經(jīng)濟(jì)。1.7 鹽析法該 法用 飽 和氯化鈉代替有機(jī)溶劑去除蛋白質(zhì)，所獲得的DNA質(zhì)量可以滿足PCR模板的要求，但產(chǎn)率相對較低，純度較差。譚建明等9對上述鹽析法進(jìn)行了改進(jìn)，即將處理過的樣本加人SDS和蛋白酶K后，在56'C 消化1h，然后用飽和氯化鈉沉淀蛋白質(zhì)，并經(jīng)離心除去，上清直接用乙醇沉淀DNA。該法簡化了DNA的抽提步驟，可用于人體各種樣本DNA的提取，所獲DNA的純度可以滿足各種檢測的需要。2 植物來源的DNA提取利用 基 因工程手段對植物進(jìn)行定向改造，已成為當(dāng)今植物育種學(xué)發(fā)展的一個新領(lǐng)域，植物基因工程操作離不開植物基因組總 DNA

13、的制備，不同植物的核酸結(jié)合蛋白的情況各不相同，因而要采取不同的提取方法10。由于植物中次生代謝產(chǎn)物 多酚類化合物可介導(dǎo)DNA降解，而多糖的污染也是影響植物DNA純度最常見的問題，這些多糖能抑制限制酶、連接酶及DNA聚合酶等酶類的生物活性。因此要從富含多酚和多糖的植物組織中分離獲得高質(zhì)量的基因組 DNA也并非易事11l。目前采用的方法有以下幾種。2.1 十六烷基三乙基澳化按(CTAB)法CTAB 是 一種陽離子去污劑，它能與核酸形成復(fù)合物，這些復(fù)合物在低鹽溶液中會因溶解度的降低而沉淀，而在高鹽溶液中可解離，從而使DNA和多糖分開，再用乙醇沉淀DNA 而除去CTAB。在該法中使用的聚維酮 (PVP

14、)與多酚結(jié)合形成復(fù)合物，從而可有效避免多酚類化合物介導(dǎo)的DNA降解121。王卓偉等13在對桑葉DNA提取方法研究過程中發(fā)現(xiàn)PVI還能有效地去除多糖。羅志勇等14在研究中對這種方法進(jìn)行了幾點改進(jìn): 提高CTAB的濃度;對于含多酚類較多的植物，增加CTAB提取緩沖液中琉基乙醇的含量，同時加人PVP使其與多酚類物質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物;增加低鹽沉淀緩沖液的量;增加高鹽溶液中鹽的濃度。用改進(jìn)的方法從人參、西洋參、三七等藥用植物中分離獲得了高純度的DNA, Porebski等1s在沉淀粗提 DNA時，將提取緩沖液中氯化鈉的濃度提高至2.5m o卜L-以使DNA在高鹽緩沖條件下優(yōu)先沉淀，可更有效地除去多糖。St

15、ein等16 對傳統(tǒng)的CTAB法進(jìn)行了優(yōu)化，創(chuàng)建了一種從新鮮草本植物樣本中提取DNA的方法。首先在特制的有96個孔的托盤上種植植物樣本，并依照不同樣本在托盤中的位置進(jìn)行編號，然后取適量植物葉子分裝在充滿提取液的塑料袋中，除去袋中的空氣并封口，再用特制的手工勻化器將各袋中的樣本混勻，56C孵育 1h后將袋中的液體取出進(jìn)行離心以及DNA 的沉淀。Xin等17則采用簡易的96孔托盤作為提取時的容器，將多種植物樣本經(jīng)研磨處理后分別放在不同的孔中進(jìn)行提取，在一天內(nèi)由一人就可完成上千個樣本的DNA提取，為高通量植物基因分析及篩選提供了極大的便利。2.2 SDS法為 了避 免 CTAB法試驗步驟多、操作繁瑣

16、的不足之處，近年來又提出了利用SDSTris- Cl- EDTA等直接裂解細(xì)胞使其釋放出DNA的方法。在該法后續(xù)的DNA純化過程中通常采用酚/氯仿處理，但對于植物 DNA純化不是一個很好的選擇，因為酚的使用可降低DNA的提取效率和純度。在用該法提取DNA的過程中采用較大的離心力和較長的離心時間，然后用氯仿一異戊醇代替酚來去除變性蛋白質(zhì)，從而克服了由于酚的摻人及殘留對以后酶切帶來的困難。用琉基乙醇代替SDS，對大豆DNA分離提取能夠更有效地去除蛋白質(zhì)，而且可以有效防止褐變，獲得天然雙鏈高分子量的DNA產(chǎn)物，并且減少了SDS對 PCR、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)(Random amplified p

17、olymorphic DNA, RAPD)等操作的影響。在對辣椒DNA進(jìn)行提取時為了提高DNA的產(chǎn)率將待提取的植物材料首先在液氮中研磨成粉末，并且針對辣椒葉子中多酚類物質(zhì)極少的特點將其中的加人PVP的步驟省去，消除了PVP對以后操作的影響.2.3 氯化千法在對稱猴桃的基因組DNA 提取過程中選用了氯化節(jié)法，與其他方法相比該法的得率較高，其原因可能是氯化節(jié)不僅可與植物細(xì)胞壁上的多糖經(jīng)基反應(yīng)生成醚，而且與細(xì)胞液中多糖物質(zhì)的All基反應(yīng)，起到破壞糖鏈的作用，利于DNA的釋放和提純。2.4 高鹽低pH法該 法 中 所用的提純試劑僅為無機(jī)鹽和異丙醇。通常采用的無機(jī)鹽為醋酸鉀，低pH的醋酸鉀是有效的蛋白質(zhì)

18、沉淀劑。與一般氯仿一異丙醇反復(fù)抽提去除蛋白質(zhì)的操作相比該法操作更方便省時，所需樣品量少，適用于瀕危植物DNA的提取。2.5 果膠酶法Ste ve n等 2s采用果膠酶對植物細(xì)胞破碎后的抽提混合物進(jìn)行消化處理使與DNA共沉淀的膠狀物質(zhì)分解成小的片段，從而無法與DNA一起沉淀下來，降低了DNA的純化難度，提高純化效率。3 微生物來源DNA的提取常規(guī) 的微 生物DNA提取多是根據(jù)某種微生物的具體特點選擇合適的方法。在實際的科學(xué)研究過程中，很多科學(xué)工作者通過實踐總結(jié)出許多快速實用的提取方法，現(xiàn)擇其中比較典型的加以總結(jié)。3.1 細(xì)菌質(zhì)粒的提取方法質(zhì)粒是獨立于細(xì)菌染色體DNA之外的環(huán)狀DNA，它能攜帶外源

19、基因進(jìn)人細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)增，或表達(dá)外源基因，是基因工程中常用的載體，在DNA重組技術(shù)、DNA測序、轉(zhuǎn)基因等方面具有廣泛的應(yīng)用。對于細(xì)菌質(zhì)粒的提取比較經(jīng)典的方法有:堿裂解法、煮沸法、SDS裂解法以及Triton-溶菌酶裂解法等。這些方法的選擇取決于質(zhì)粒的大小、細(xì)菌菌株的性質(zhì)等。Keunosky等GE_發(fā)展了一種以 Zn'+誘導(dǎo)DNA沉淀的方法，在該法中利用一定濃度的ZnCl:溶液使一定體積的細(xì)菌菌液質(zhì)粒DNA大量沉淀，無需多次離心，大大簡化了抽提的步驟。近年 來 ，一些生物技術(shù)公司，比如Promega公司及Qiagen公司等紛紛推出質(zhì)粒抽提試劑盒，這些試劑盒多運用樹脂材料或硅膠來特異性的吸附質(zhì)

20、粒DNA，提取過程用時少，效率高。 3.2 真菌DNA提取方法對 真菌 DNA的提取關(guān)鍵是破碎細(xì)胞，通常采取酶解破壁法或以液氮冷凍處理增加細(xì)胞壁脆性的物理破壁法。在這兩種方法中酶解破壁法較為簡單，易于操作和控制，而物理破壁法在處理過程中容易造成細(xì)胞核的大量破損。在提取獲得核酸一蛋白質(zhì)復(fù)合物后，對其中蛋白質(zhì)的沉淀也多采用傳統(tǒng)的氯仿一異戊醇沉淀法或高鹽沉淀法。韓利剛等C25用CTA13法直接從絲狀真菌的新鮮菌絲中提取DNA，并將所提取的DNA進(jìn)行 RAPD，得到了較清晰的擴(kuò)增圖譜。Loeffler 等Z6為滿足快速靈敏準(zhǔn)確的臨床檢驗的需要，利用MagNA Pure LC系統(tǒng)建立了一種實用的快速提取

21、方法，該法自動化程度高，避免了可能的交叉污染。Manian等z7在對真菌進(jìn)行DNA抽提時采用幾個循環(huán)的快速制冷、煮沸以破碎真菌細(xì)胞壁，并通過Qiagen 公司的QIAquick DNA純化柱，迅速從極微量的真菌中獲得高純度的DNA大分子。3.3 結(jié)核桿菌DNA的提取方法利用 PC R微孔板雜交技術(shù)檢測臨床標(biāo)本中結(jié)核桿菌DNA是診斷結(jié)核桿菌感染的一種快速靈敏和特異的方法。從不同的臨床標(biāo)本中獲得DNA是檢測準(zhǔn)確和成功的關(guān)鍵。而不同來源的結(jié)核桿菌又分別受到不同來源材料的影響，所以提取方法各不相同。同時由于結(jié)核桿菌的細(xì)胞壁比較厚不易破碎，一般的微波法、異硫氰酸肌法、凍融法等難以破壞結(jié)核桿菌的細(xì)胞壁。通

22、常采取的方法有:經(jīng)典酶一酚一氯仿法，堿一SDS裂解法，堿裂解煮沸法，超聲裂解法，Chelex-100 法，玻璃粉一硅吸附法等。楊正林等28通過對以上幾種方法的比較發(fā)現(xiàn)玻璃粉一硅吸附法操作簡單，假陽性低，適合臨床檢測使用。3.4 土壤微生物總DNA的提取方法土壤 中 細(xì) 菌的含量豐富，種類齊全，從中提取細(xì)菌DNA可用于檢測不可培養(yǎng)的細(xì)菌，跟蹤某些目標(biāo)菌或重組基因在自然環(huán)境中的行為，也可用來解釋土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)中的基因的多樣性及其隨環(huán)境的變化。從土壤中提取和純化DNA是最關(guān)鍵的技術(shù)之一。 Courtoi:等29對比了在土壤中直接裂解微生物體、然后提取DNA和先將微生物菌體通過梯度離心與土壤顆粒分

23、開再進(jìn)行提取的方法，利用PCR技術(shù)以及雜交技術(shù)檢測不同方法獲得DNA的種類和純度，發(fā)現(xiàn)前一種方法具有更高的效率，能夠提取獲得較多微生物物種的 DNA。張瑞福等30采用SDS高鹽提取法和透析袋回收法對9種不同來源的土壤進(jìn)行微生物DNA的提取，與通常采用的對菌體細(xì)胞的超聲破碎法以及對粗提DNA的微型柱純化法相比，既保證了一定提取與回收效率，又兼顧了DNA的質(zhì)量，使DNA在提取和純化過程中不會受到損傷。4 海洋生物DNA的提取方法海洋 是 地 球上最大的生物資源庫，同時由于海水的保護(hù)使海洋生物變化很少，物種得到較好的保存，這樣就為研究生命現(xiàn)象的基本問題提供了豐富的資料。在利用這些資源探討諸如生命的起

24、源、生物進(jìn)化、生物與環(huán)境的關(guān)系、改造海洋生物以為人類服務(wù)(如生產(chǎn)某種藥物)時離不開對生物核酸的研究。對于海洋來源的動物、植物、微生物由于其不同于陸生生物的組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)特點往往采用不同的DNA提取方法。張海 琪 等 31_在對不同方法保存的大黃魚(Pseudosciaena crocea)肌肉樣品基因組 DNA進(jìn)行提取時發(fā)現(xiàn)，經(jīng)福爾馬林、乙醇及含有EDTA的乙醇保存的樣品可以同鮮活樣品和冷凍樣品一樣獲得基因組DNA，但相比之下采用乙醇作為固定劑更方便快速，所提取的DNA用于RAPD分析，獲得了滿意的效果。楊文新等32利用75%的乙醇固定鮑魚(Haliotis discus)樣本并進(jìn)行DNA的提

25、取，證明用乙醇固定海洋動物組織是一種切實可行的方法，材料處理后可同步提取，增加了實驗的同步性、可比性，適用于大量樣本的提取。由于組織中含有許多DNA酶，絕大多數(shù)DNA酶需要一個二價陽離子作為輔助因子，因此采用含適量EDTA的乙醇固定劑是野外標(biāo)本采集和運輸?shù)囊环N更簡便有效的方法。 韓兵 社 等 33:針對傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑提取工藝進(jìn)行改進(jìn)，應(yīng)用多種萃取液體系從廢棄物魷魚肝臟中提取核酸，與原工藝相比，核酸提取產(chǎn)量提高30%-60%，整體工藝得到簡化，而且避免了有機(jī)物的殘留。  赤 潮 是 在特定的環(huán)境前提條件下，海水中的某些浮游生物、原生動物或細(xì)菌爆發(fā)性增殖或高度聚集而引起水體變色的一種有害

26、生態(tài)現(xiàn)象，對海洋漁業(yè)、水產(chǎn)資源以及人類的健康造成很大的威脅。發(fā)生赤潮的生物類型主要為藻類，銅綠微囊藻(Microcytis aeruginosa) 是造成赤潮的藻類之一。陸源等34用乙醇乙醚混合液對純化的銅綠微囊藻作預(yù)處理，破壞了其膠質(zhì)鞘，從而使蛋白酶K和 SDS能更好地直接作用于其細(xì)胞壁，細(xì)胞內(nèi)的DNA釋放完全，提高了總DNA的得率。通過提取獲得的DNA有助于開展對有害藻類的研究，為防范赤潮提供依據(jù)。 在對 紫 菜 (Porphyras p.)進(jìn)行DNA提取時，郭寶太等35先用海螺酶處理樣品制備紫菜體細(xì)胞，然后用SDS和蛋白酶K裂解細(xì)胞提取總DNA，再用Wizard DNA cle

27、an-up;樹脂進(jìn)行純化。經(jīng)海螺酶處理的紫菜細(xì)胞解決了通常采用的液氮破碎細(xì)胞后裂解物勃稠、DNA得率低且有嚴(yán)重的多糖污染等難題。但這種方法對植物組織需求量較多，不適于個體體積小的紫菜。劉必謙等36采用美國Roche公司的DNA Isolation Kit for Cell and Tissue和上海生工公司的UNIQ- 10小量柱式基因組DNA提取試劑盒對個體體積較小的圓紫菜(Porphyra suborbiculato )、鐵釘菜(Ishige okamurae)等進(jìn)行DNA 的提取，獲得高純度的基因組DNA，完全能滿足酶切片段長度多態(tài)性(Amplified Fragment Length

28、Polymorphism, AFLP)技術(shù)的需要。陳子 桂 等371以海洋尾絲蟲(Uronema marinum)為材料，針對纖毛蟲難以建立培養(yǎng)以及個體豐度不高等特點，就微量條件下提取DNA的方法進(jìn)行了探討，成功地獲得了活體直接提取、活體酚/氯仿抽提、固定標(biāo)本直接提取以及固定標(biāo)本酚/氯仿抽提等四種簡便有效的微量DNA提取方法，解決了纖毛蟲微量DNA提取的困難。綜合 DN A的提取方法，雖然不同生物 DNA的提取方法不盡相同，但各種提取方法也有很多相通之處，可以相互借鑒。隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，對這一技術(shù)的經(jīng)驗總結(jié)將會越來越多，一些生物領(lǐng)域新的DNA提取方法也將逐漸固定下來，更為簡捷、高效的方法

29、也必將出現(xiàn)，為基因工程提供更高純度的DNA.1）學(xué)習(xí)并掌握動物組織總DNA的提取方法及其原理。（2）從肝臟組織中提取到一定量的純凈的DNA樣品。【實驗原理】DNA是一切生物細(xì)胞的重要組成成分，主要存在于細(xì)胞核中。通過研磨和SDS作用破碎細(xì)胞；苯酚和氯仿可使蛋白質(zhì)變性，用其混合液（酚：氯仿：異戊醇）重復(fù)抽提，使蛋白質(zhì)變性，然后離心除去變性蛋白質(zhì)；RNase降解RNA，從而得到純凈的DNA分子?！緝x器、材料、試劑】（一）儀器1高速離心機(jī)2烘箱3冰箱4水浴鍋5微量移液器6高壓滅菌鍋（二）材料1生理鹽水2十二烷基硫酸鈉（SDS）3三羥甲基氨基甲烷（Tris）4乙二胺四乙酸（EDTA）5飽和酚6氯仿7異

30、戊醇8無水乙醇975%乙醇10蛋白酶K11RNase酶12手術(shù)剪刀、鑷子、吸水紙13微量取液器14研缽、1.5mL 離心管、一次性手套、1.5mL離心管架、記號筆（三）試劑配制1TrisHCL 1mol/L PH8.0 50ml配制方法：40ml雙蒸水，6.057g固體Tris放入燒杯中溶解，用濃鹽酸調(diào)PH值到8.0，轉(zhuǎn)移到50ml容量瓶中，加入雙蒸水定容，搖勻后，轉(zhuǎn)到準(zhǔn)備好的輸液瓶中，貼上標(biāo)簽，高壓滅菌后，降至室溫，4保存?zhèn)溆谩?生理鹽水: 0.85%NaCL 100ml配制方法：在20ml雙蒸水中溶解0.85g固體NaCL，加水定容至100ml，搖勻后，轉(zhuǎn)到準(zhǔn)備好的輸液瓶中，貼上標(biāo)簽，高壓

31、滅菌后，降至室溫，4保存?zhèn)溆谩?EDTA 0.5mol/L PH8.0 50ml配制方法：將9.08g的EDTA·Na2·2H2O溶解于40ml雙蒸水，用1g的NaOH顆粒（慢慢逐步加入）調(diào)PH值到8.0，用50ml容量瓶定容，如果EDTA難溶，先加NaOH溶解，然后逐步加EDTA·Na2·2H2O。4TES緩沖液（釋放DNA） 100ml配制方法：將0.5844g的5 mol/lNaCl溶解于80ml雙蒸水，在分別加入1ml的0.5 mol/l EDTA、0.2ml的Tris-HCl (pH=8.0)，加定容至100ml, 搖勻后，轉(zhuǎn)到準(zhǔn)備好的輸液瓶中，貼上標(biāo)簽，高壓滅菌后，降至室溫，4保存?zhèn)溆谩?10% SDS（變性劑 破細(xì)