側(cè)柏葉醇提取物抗炎作用的研究(精)

1、中 國 藥科大學(xué)學(xué)報Journal of Chi na P harmaceutical Un iversity 2001,32(3 :224226側(cè)柏葉醇提取物抗炎作用的研究匚 L |統(tǒng)3,覃燕梅1,梁念慈1（廣東天然藥物研究開發(fā)實驗室,1廣東醫(yī)學(xué)院生化教研室,湛江524023摘 要目的：探討側(cè)柏葉醇提取物的抗炎機理。方法：以大鼠胸腔白細胞 及兔血小板為材料，用高效液相 色譜法測定細胞白三烯、122羥十七碳三烯酸及122羥廿碳四烯酸的生成。結(jié)果：側(cè)柏葉醇提取物對白細胞內(nèi)白 三烯B 4及52羥廿碳四烯酸的生物合成有較強的抑制作用 ,其IC 50值分別為含生藥0. 4mg/ml及 生藥0. 41m

2、g/ml 。側(cè)柏葉醇提取物還可顯著抑制血小板 122羥十七碳三烯酸的生物合成。結(jié)論：側(cè)柏葉醇提取物中含有較強的抗 炎成分，其作用機制與抑制花生 四烯酸的代謝有關(guān)。關(guān)鍵詞 側(cè)柏葉；白三烯B 4; 122羥十七碳三烯酸中圖分類號：R972+. 4;R94414文獻標(biāo)識碼:A文章編號:1000（200120224側(cè)柏葉（Biota orientalis為傳統(tǒng)中藥,止血、清肺止咳、抑菌等功能1(PAF拮抗PAF Pinus olide 2,3;側(cè)柏葉乙酸乙酯 提取物具有松馳氣管平滑肌的作用 4。我們在篩 選抗炎藥物的過程中，發(fā)現(xiàn)側(cè)柏葉醇提取物具有較 強的抗炎活性， 為進一步探討其抗炎機制，本研究從花生

3、四烯酸代謝的三個主要途徑 52脂氧合 酶、環(huán)加氧酶及122脂氧合酶代謝途徑探討其醇提取物對白三烯B 4(LT B 4、52羥廿碳四烯酸(52HETE、122羥 十七碳三烯酸(122HHT和122羥廿碳四烯酸 (122 HETE生物合成的影響。1 儀器與試藥1. 1 試劑花生四烯酸、LT B 4、52HETE、122HHT、鈣離子載體A23187、角叉菜 膠、槲皮素、5,8,11,142eicosate 2 traynoic acid (ETY A為 Sigma 公司產(chǎn)品，乙 腈、甲醇(色譜純，其余為分析純試劑。側(cè)柏葉購自湛江藥 材公司，經(jīng)本實驗室 茍占平碩士鑒定為 Platychadus or

4、ie ntalis (L. Fran co.。用95%乙醇回流提取、濃縮 成浸膏，含生藥為10. 5g/g。Wistar大鼠，3kg大白兔,均由。1.3 儀器采用島津公司的LC 210ADVP液相色譜系統(tǒng)，分析柱為S pheris orb C18,250 X 4. 6mm ,5 大連依 利特公司。2方法211細胞制備2. 1. 1測定52脂氧合酶細胞懸浮液的制備5乙醚麻醉正常雄性大鼠，于 右胸腔注射1%角叉菜膠0. 2ml ,5h后將大鼠斷頭處死，吸出胸腔滲出液，加入2mlP BS溶液中(內(nèi)含肝素12. 5u/ml ,加2 ml P BS溶液沖洗胸腔,與滲出液合并，2000r/min離心10m

5、in ,沉淀細胞加入2ml冷凍蒸餾水溶解紅 細胞,1min后立即 加入1.8%NaCI （內(nèi)含肝素12. 5 u/ml 2ml , 2000r/min離心5min ,沉淀用P BS溶液 懸浮配成白細胞懸浮液（1沐07細胞/ml。含中性粒細胞約85%。2. 1.2 分析環(huán)加氧酶及122脂氧合酶兔血小板的 制備 抽兔心臟血用100mm ol/L E DT A按14 : 1抗凝，1000r/min離心8min ,吸取富含血小板血漿422日收稿日期2001201202 3通訊作者 T el :075922388405 E 2mail :liangtgdmc. cn基金項目：廣東省衛(wèi)生廳基金資助項目 （

6、2000486(P latelet 2rich P lasma , PRP 3000r/mir離心 10min ,用含 1mg/ml E DT A P BS 溶液沖洗血小板，2500r/ min離心10min ,血小板懸浮于P BS溶液中，調(diào)血小板濃度為2. 5 W8細胞/ml 。2. 2 溫孵及產(chǎn)物的提取2. 2. 1 52脂氧合酶溫孵及產(chǎn)物的提取參照文獻6,取白細胞懸液1ml ,加藥或溶劑（二甲亞砜濃 度少于0. 5% ,每個藥物濃度做3次，以槲皮素（quercetin作 陽性對照。于37r溫孵10min ,加入下列物質(zhì)，并使終濃度分別為:Ca 2+2. 0mm ol/L , Mg 2+0

7、. 5mm ol/L ,花生四烯酸 40 卩 m ol/L ,鈣離子載 體 A231873 卩 m ol/L ,繼 續(xù)溫孵5min ,立即加入5ml乙酸乙酯（內(nèi)含20卩冰醋酸終止反應(yīng)及200ng安定作 內(nèi)標(biāo),旋渦振蕩2min ,轉(zhuǎn)移上層乙酸乙酯4. 5 ml ,氮氣吹干,殘渣用30卩甲醇溶 解,5卩進樣用反相高效液相色譜分析。2. 2. 2 環(huán)加氧酶及122提取41, 52酶測定，。2. 32. 3. 1 52脂氧合酶產(chǎn)物L(fēng)T B 4及52HETE的測定 流動相A ,甲醇2水2 乙酸（30 : 70 : 0. 05,pH 310 ,流動相B :乙腈2甲醇2水2乙酸（60 : 20 : 20：

8、0.05,pH 3. 0 ;梯度洗脫,從含流動相B 65%開始，15min B增加到100%,分析過程 20min ,流速1.0ml/min ;用雙波 長同 時檢測,275nm測LT B 4, 235nm測52HETE ,其峰高與內(nèi)標(biāo)安定（兩個波長都有吸收 之比值表示相對含量。2. 3. 2 環(huán)加氧酶產(chǎn)物122HHT及122脂氧合酶產(chǎn)物122HETE的測定 采用235nm波長測122HHT及122HETE ,其余條件同52脂氧合酶產(chǎn)物測定。3結(jié)果3. 1 側(cè)柏葉醇提取物對白細胞LT B 4及52HETE生物合成的影響用不同濃度的側(cè)柏葉醇提取物與白細胞懸液一起溫孵，在生藥濃度0. 20.8mg/

9、ml的范圍內(nèi)，側(cè)柏葉對外源性花生四烯酸轉(zhuǎn)變成 52HETE及LT B 4的抑制作用呈量效關(guān)系，其IC 50分別為含生藥0. 41,0. 40mg/ml ;用槲皮素作陽性對照，0.85卩g/ml （2. 5nm ol/ml的濃度對52HETE及LT B 4的抑制率 分另為47. 6%及46.4%,結(jié)果見表1。T ab 1. E ffect of the extract from Biota orie ntalis on 52HETE and LT B 4for 2 mation ( x s ,± =3Drugmg ? ml -1Inhibitory rate (% IC 50(c /m

10、g ? ml -1 52HETE LT B 452HETE LT B 4 C ontrol 0-E BO 0. 2013. 3 0. ±15. 2 0.±0. 410. 40 0. 4045. 8 2. 747.± 1.±0. 6068. 1 2±67. 5 2±0. 8090. 8 3±92. 2 2±Quercetin a 0. 8547. 63. 146.4 2±1. 7086. 2 2±89. 3 3±E BO :Extract of Biota orientalis ; a

11、c /? ml -1 卩 g3. 2側(cè)柏葉醇提取物對血小板122HHT及122 HETE合成的抑制作用2,分別,于血小,122HHT合成作用，IC 50為0. 54mg/ml生藥,而1mg/ml的濃度未 顯示對122HETE合成的抑制作用。以環(huán)加氧酶、122脂氧合酶雙通道抑制劑ETY A作陽性對照,10卩m ol/L (2. 9卩的/rETY A對血小板122HHT及122HETE的合成的抑制率分別為 88. 0%及9414%,見表2。T ab 2. E ffect of the extract from Biota orie ntalis on 122HHT and 122HETE form

12、ation ( x s , ±=3Drugmg ? ml -1Inhibitory rate (% IC 50(c /mg ? ml -1 122HHT 122HETE 122HHT control 0-E BO 0. 2518. 5 1. ±-2. 4 0. ±30. 540. 5043. 2 1.左0. 5 0.=231.0072. 9 2±2. 8 1±3a 2. 9088. 0 3. ±4. 4 4±a c / f?g ml -1 3P <0. 05(vs controlLT B 4和52HETE是花生四烯酸的

13、代謝產(chǎn)物，前者是白細胞的強趨化劑和激 活劑，后者為白細胞的 激活劑，在炎癥過程中起重要作用。LT B 4和52 HETE在白細胞中的生物合成主要涉及磷脂酶 A 2和52脂氧合酶的活性，若加入過量外源 性花生四烯酸,則生成LT B 4及52HETE的量主要反映52脂氧合酶的活性。本研究結(jié)果顯示,側(cè)柏葉對白細胞522梁統(tǒng)等：側(cè)柏葉醇提取物抗炎作用的研究LT B 4及52HETE的生物合成有較強的抑制作用，提示側(cè)柏葉是通過抑制52脂氧合酶的活性發(fā)揮作用。在血小板中花生四烯酸可經(jīng)環(huán)加氧酶途徑生成122HHT及經(jīng)122脂氧合酶途徑轉(zhuǎn)變?yōu)?22HETE , 122 HHT是白細胞趨化劑，可作為反映環(huán)加氧酶

14、活性的指標(biāo)7210,側(cè)柏葉亦顯示了對環(huán)加氧酶較強的抑制作用，提 示側(cè)柏葉中含有較強的抑制52脂氧合酶及環(huán)氧化酶的成分，表明了側(cè)柏葉具有進步開發(fā)研究的前景。參考文獻1李世全（Li S Q .秦嶺巴山天然藥物志M.西安：陜西科學(xué)技 術(shù)出版社，1987. 362236312 Y ang H O , Suh DY, Han BH. Is olation and characterizati on of p latelet 2activati ng factor rece ptor bi nding an tag oni sts from Biota ori 2 en talis J. Pla nta

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20、gdong Medical CollegeAbstract AIMThe purp ose is to inv estigate the Anti 2in flammatorymecha nism of Biota orie ntalis . METH ODSUsing rat leukocytes and rabbit p latelets as exp erime ntal material the bios yn thesis of leukotrie ne , 122hydroxyhe ptade 2 catrie noic acid (122HHT and 122hydroxyeicosatetrae noic acid (122HETE in the cells was determi ned with HP LC. RESU LTS Bio