集落刺激因子對(duì)慢性腦缺血成年鼠膠質(zhì)細(xì)胞可塑性及記憶改善的影響

1、集落刺激因子對(duì)慢性腦缺血成年鼠膠質(zhì)細(xì)胞可塑性及記憶改善的影響    【關(guān)鍵詞】 慢性腦缺血;粒細(xì)胞集落刺激因子;膠質(zhì)細(xì)胞可塑性;學(xué)習(xí)記憶;海馬 Treatment effects of GCSF on gliacyte plasticity and cognitive function in chronic cerebral hypoperfued adult rats SHU Xiji,LIU Wei,ZHOU Hongyan,XIONG Weipeng,et al. Department of pathology and pathophysiolog

2、y,medicine college,Jianghan University,Wuhan 430056,China 【Abstract】 Objective To explore effect of rhGCSF on gliacyte plasticity and cognitive handicap in chronic cerebral hypoperfusion adult rats.Methods 45 maleSDthreemonth rats were randomly divided into ischemic model group,control group and rhG

3、CSFtreated group,each group has 15 rats.Spatial learning and memory was accessed by Morris Water Maze,immunohistochemistry and image analysis were employed to detected the number and cytoplasmic process length of GFAP positive cell in hippocampal CA1 region.Results GFAP positive cells of ischemic mo

4、del group was significant less than control group(P【Key words】 Chronic cerebral hypoperfusion;RhGCSF;Gliacyte plasticity; Learning and memory; Hippocampus 有關(guān)慢性腦缺血損傷后認(rèn)知障礙的康復(fù)治療一直是臨床熱點(diǎn),以往多關(guān)注神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)對(duì)認(rèn)知預(yù)后的影響。目前研究發(fā)現(xiàn),膠質(zhì)細(xì)胞的修復(fù)對(duì)認(rèn)知功能改善的作用同樣至關(guān)重要,膠質(zhì)細(xì)胞可以通過(guò)改變自身特性以適應(yīng)內(nèi)外環(huán)境的損傷刺激而具有可塑性,包括細(xì)胞數(shù)量的增加,細(xì)胞胞體突起長(zhǎng)度上的變化,非星狀及放射狀細(xì)胞向

5、星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)轉(zhuǎn)化等,其中以細(xì)胞胞體突起長(zhǎng)度變化最為明顯1。膠質(zhì)細(xì)胞可塑性在神經(jīng)信息傳遞、整合和調(diào)控等促進(jìn)認(rèn)知改善的過(guò)程中起關(guān)鍵作用2。重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhGCSF)對(duì)于造血細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化起重要介導(dǎo)作用,具有刺激骨髓干細(xì)胞遷移、增殖、分化、成熟等生物學(xué)功能。本研究構(gòu)建慢性腦缺血模型,從膠質(zhì)細(xì)胞可塑性改變及學(xué)習(xí)記憶功能改善的角度,探討rhGCSF對(duì)慢性腦缺血損傷的修復(fù)作用。 1 材料與方法 1.1 建模與分組 3月齡雄性清潔級(jí)SD大鼠45只,體重(287±37)g,隨機(jī)分為缺血組、對(duì)照組和干預(yù)組,每組15只。1%戊巴比妥鈉3540 mg/kg麻醉大鼠,分離并結(jié)扎雙側(cè)頸總

6、動(dòng)脈,作為缺血組。假缺血的對(duì)照組僅分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈但不結(jié)扎。大鼠術(shù)后再常規(guī)飼養(yǎng)6個(gè)月,期間有8只死亡,最后存活鼠缺血組11只、對(duì)照組14只、干預(yù)組12只。干預(yù)組rhGCSF(齊魯制藥公司產(chǎn)品)的劑量為10 g/kg;缺血組、對(duì)照組采用生理鹽水作為安慰劑,均皮下注射,手術(shù)6個(gè)月后連續(xù)3 d,停藥5 d,完成學(xué)習(xí)記憶功能評(píng)估后立即處死大鼠,取材制片。 1.2 學(xué)習(xí)記憶功能評(píng)估 通過(guò)定位航行實(shí)驗(yàn)評(píng)估大鼠空間學(xué)習(xí)能力,空間探索實(shí)驗(yàn)評(píng)估大鼠空間記憶能力。評(píng)估實(shí)驗(yàn)前1 d,讓大鼠在無(wú)逃逸平臺(tái)的水池中適應(yīng)性游泳2 min。定位航行實(shí)驗(yàn):連續(xù)5 d,每天上午同一操作者將大鼠面向池壁從不同象限入水,找到平臺(tái)后站

7、立15 s,記錄其找到隱匿平臺(tái)所耗的逃逸時(shí)間,再?gòu)钠脚_(tái)上移開(kāi)休息60 s后進(jìn)行下一輪實(shí)驗(yàn)。若在120 s內(nèi)大鼠未找到平臺(tái),由操作者引導(dǎo)上平臺(tái),逃逸時(shí)間記為120 s?？臻g探索實(shí)驗(yàn):完成定位航行實(shí)驗(yàn)后撤去平臺(tái),將大鼠從平臺(tái)所在的對(duì)面象限中放入水池,記錄2 min內(nèi)大鼠穿過(guò)平臺(tái)所在區(qū)域的次數(shù)及停留于平臺(tái)所在象限的時(shí)間。        1.3 海馬膠質(zhì)細(xì)胞可塑性的圖像分析 4%多聚甲醛全身灌注固定,取含海馬結(jié)構(gòu)的組織制片。免疫組化染色采用即用型GFAP抗體及PV9000試劑盒完成。設(shè)PBS為一抗陰性對(duì)照、已知陽(yáng)性切片為陽(yáng)

8、性對(duì)照,GFAP以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕色顆粒為陽(yáng)性。采用MOTIC Med 6.0分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。在海馬CA1區(qū)隨機(jī)選定起始區(qū)后連續(xù)采集5個(gè)“400?”視野,以“個(gè)/視野”為單位記錄GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。同時(shí),每個(gè)高倍視野隨機(jī)選取10個(gè)形態(tài)明確胞質(zhì)突起完整的GFAP陽(yáng)性細(xì)胞,記錄每個(gè)待測(cè)細(xì)胞最長(zhǎng)胞質(zhì)突起的長(zhǎng)度(m)。 1.4 統(tǒng)計(jì)分析 測(cè)量數(shù)值用x±s表示,組間比較采用LSD法方差分析,空間記憶功能與細(xì)胞數(shù)目變化的相關(guān)性分析采用Pearson法,其他數(shù)據(jù)采用單因素方差分析。P2 結(jié)果 2.1 rhGCSF對(duì)空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響 定位航行實(shí)驗(yàn)中,隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加,各組大鼠找到隱匿平臺(tái)的

9、逃逸潛時(shí)間逐漸減少(表1)。缺血組的整體逃逸時(shí)間明顯多于對(duì)照組(P<0.01),干預(yù)組逃逸時(shí)間明顯少于缺血組(P<0.01)?？臻g探索實(shí)驗(yàn)中,缺血組大鼠停留于平臺(tái)所在象限的時(shí)間(12.16±4.33)較對(duì)照組(19.32±5.41)明顯減少(P<0.05),缺血組大鼠穿過(guò)平臺(tái)的次數(shù)(4.36±1.95)較對(duì)照組(11.08±3.74)明顯減少(P<0.01)。干預(yù)組大鼠停留于平臺(tái)所在象限的時(shí)間(15.76±4.53)明顯高于缺血組(P<0.05),干預(yù)組大鼠穿過(guò)平臺(tái)的次數(shù)(8.47±2.71)明顯多于缺血

10、組(P2.2 海馬CA1區(qū)的膠質(zhì)細(xì)胞可塑性觀察 就膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量變化而言,缺血組(28.67±5.97)海馬CA1區(qū)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目較對(duì)照組(59.48±8.63)明顯減少(P<0.01),干預(yù)組海馬CA1區(qū)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞(39.25±4.83)較缺血組明顯增多(P2.3 大鼠空間記憶能力與膠質(zhì)細(xì)胞可塑性的相關(guān)性分析 各組大鼠海馬CA1區(qū)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)突起長(zhǎng)度的變化與對(duì)應(yīng)的平臺(tái)所在象限停留時(shí)間(r=0.615,F=0.613,P3 討論 慢性腦缺血是血管性癡呆、Alzheimer、Binswanger等多種慢性腦血管病的共同病理過(guò)程,可致器質(zhì)性中樞

11、神經(jīng)損傷和功能性認(rèn)知障礙。rhG-CSF作為一種多潛能的造血生長(zhǎng)因子,可動(dòng)員外周血骨髓干細(xì)胞向中樞系統(tǒng)遷移,分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞,修復(fù)中樞系統(tǒng)損傷。海馬是腦缺血損傷最敏感的區(qū)域之一,與學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能密切相關(guān)。本研究著重探討rhG-CSF對(duì)慢性腦缺血后海馬膠質(zhì)細(xì)胞可塑性及記憶功能的影響。 星形膠質(zhì)細(xì)胞為最主要的膠質(zhì)細(xì)胞,GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性分子標(biāo)記物。本研究通過(guò)病理組織學(xué)觀察分析星形膠質(zhì)細(xì)胞可塑性發(fā)現(xiàn),對(duì)照組GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量最多、胞質(zhì)突起長(zhǎng)度最長(zhǎng),干預(yù)組次之,缺血組GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量最少、胞質(zhì)突起分支少而短小,部分GFAP陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)突起崩解。通過(guò)定位航行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),干預(yù)組大

12、鼠逃逸時(shí)間顯著低于缺血組,提示rhG-CSF干預(yù)后慢性腦缺血大鼠學(xué)習(xí)障礙明顯改善。空間探索實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),干預(yù)組大鼠平臺(tái)所在象限的停留時(shí)間及跨越平臺(tái)次數(shù)均顯著高于缺血組,提示rhG-CSF治療后大鼠記憶障礙明顯改善。由此證實(shí),rhG-CSF可有效改善慢性腦缺血大鼠的認(rèn)知障礙。對(duì)照組與缺血組、干預(yù)組與缺血組的GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及胞質(zhì)突起長(zhǎng)度的組間分析,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,前者提示慢性腦缺血對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷,后者提示rhG-CSF可有效促進(jìn)缺血海馬的星形膠質(zhì)細(xì)胞可塑性變化。 本研究對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞可塑性與認(rèn)知記憶改善趨勢(shì)的進(jìn)一步相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),各組GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量及其胞質(zhì)突起長(zhǎng)度變化,與大鼠停留于平臺(tái)

13、所在象限的時(shí)間、穿過(guò)平臺(tái)區(qū)域次數(shù)均呈正相關(guān),提示rhG-CSF可通過(guò)激活星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增生、胞質(zhì)突起長(zhǎng)度延長(zhǎng)等可塑性變化,來(lái)促進(jìn)大鼠空間記憶能力的改善。新生星形膠質(zhì)細(xì)胞可為神經(jīng)細(xì)胞遷移提供腳手架,神經(jīng)細(xì)胞軸突生長(zhǎng)沿星形膠質(zhì)細(xì)胞突起形成的架橋爬行遷移,形成有效的軸突通路。同時(shí),新生星形膠質(zhì)細(xì)胞可釋放出興奮性氨基酸、前列腺素等神經(jīng)活性物質(zhì),調(diào)控神經(jīng)元的功能3,促進(jìn)神經(jīng)元間突觸網(wǎng)路的建立,增加傳導(dǎo)速度4。星形膠質(zhì)細(xì)胞還在突觸發(fā)生、突觸傳遞的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要功能5,是神經(jīng)信息傳遞、整合和調(diào)控過(guò)程中的關(guān)鍵角色2,rhG-CSF干預(yù)后的膠質(zhì)細(xì)胞可塑性變化,可能是學(xué)習(xí)記憶損害后功能改善的重要病理修復(fù)機(jī)制之一

14、。但rhG-CSF通過(guò)誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞可塑性變化來(lái)改善認(rèn)知障礙的神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制,還有待進(jìn)一步深入研究。 參 考 文 獻(xiàn) 1 商永華,王群,陸兵勛,等.慢性腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶變化及甲狀腺激素的影響.中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志,2007,22(3):209-211. 2 Halassa MM,Haydon PG.Integrated brain circuits:astrocytic networks modulate neuronal activity and behavior.Annu Rev Physiol,2010,172:335-355.        3 Tsuda M,Shigemoto-Mogami Y,Koizumi S,et al.P2X4 receptors induced in spinal microglia gate tactile allodynia after nerve injury.Nature,2003,424(6950):778-783. 4 Ullian EM,Sapperstein SK,Christopherson KS,et al.Contr