P-選擇素與心肌缺血再灌注損傷

1、    P-選擇素與心肌缺血再灌注損傷        摘要：在急性心肌梗塞血管內(nèi)溶栓、經(jīng)皮冠狀動脈內(nèi)成形術(shù)、體外循環(huán)等治療過程中，患者面臨心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusion;I/R）損傷問題。心肌I/R損傷涉及多種因素，包括氧自由基產(chǎn)生、Ca2+超負荷、血管活性物質(zhì)釋放、中性粒細胞的浸潤，尤其是后者，因它與活化血小板、內(nèi)皮細胞的相互作用，經(jīng)級聯(lián)（cascade）反應(yīng)產(chǎn)生大量酶、氧自由基及形成血栓，在心肌I/R損傷中起關(guān)鍵作用。而P-選擇素（P-selec

2、tin;Ps）是這一系列事件的始動條件，因此對Ps進行深入研究，對于揭示心肌I/R損傷機制，防治臨床上心肌I/R損傷，具有重要意義。關(guān)鍵詞：P-選擇素；心肌缺血；再灌注損傷中分類號：R541.4;Q516文獻標識碼：A文章編號：1004-3934（2000）04-0230-04 P-selectin and Myocardial Ischemia/Reperfusion InjuryYING Shu-qin,SHAN Jiang,XU Geng(Department of Cardiology,Second Affiliated Hospital of Zhejiang University

3、Medical College,ZhejiangHangzhou310009)Ps屬于細胞粘附分子中的選擇素家族，又名GMP-140（granule membrane protein)、CD62P、PADGEM（platelet activation-dependent granule-external membrane)，它貯存于靜息血小板的-顆粒中、內(nèi)皮細胞的Weibel-Palade體上。當上述細胞受到凝血酶等激活時，顆粒膜即與質(zhì)膜融合，通過出胞作用使Ps表達在質(zhì)膜上1。另外，Ps還表達在巨噬細胞、HEL（人紅白血?。┘毎?。Ps與動脈粥樣硬化、心肌梗塞、心肌I/R損傷等疾病關(guān)系密切。本

4、文著重探討Ps在心肌I/R損傷中的病理作用及其可能機制。1Ps的生物學特性Ps是一種分子量為140kD(14×104u）的膜蛋白，由一條多肽鏈組成，其結(jié)構(gòu)具有選擇素家族的共性，分為五個區(qū)域，具體如下：NH4SIGLECTINEGFCR1CR2CR3CR4CR5CR6CR7CR8CR9TMCTYOCOOH一個位于NH2末端依賴Ca2+的C型植物素樣區(qū)域（LECTIN）、一個表皮生長因子區(qū)域（EGF）、九個重復(fù)的補體調(diào)節(jié)蛋白序列區(qū)域（CR1-9）、一個跨膜區(qū)域（TM）、一個短的胞漿尾部（CTYO）2。Johnston等3首先檢測出其編碼基因包含5萬個鹼基對，由18個外顯子和17個內(nèi)含子組

5、成，每個區(qū)域由不同的外顯子編碼。由于編碼基因可選擇地不同組合，使Ps存在三種不同的分子形式：其中兩種含跨膜片段，僅結(jié)合區(qū)域中重復(fù)序列數(shù)不同；另一種不含有14號外顯子編碼的跨膜區(qū)域，成為一種血漿可溶狀態(tài)，表現(xiàn)出不同的生物學特性。Ps有幾種不同特性的可能配體：Lex(5乙酰神經(jīng)氨酸2-3）半乳糖1-4（巖藻糖1-3）N乙酰氨基葡萄糖-R）、Sialyl-Lex（唾液酸化的Lex）、硫酸葡聚糖、腦硫酯等。Lex、Sialyl-Lex是一種寡糖結(jié)構(gòu)，廣泛分布于各種細胞的糖蛋白和糖脂上，包括中性粒細胞和單核細胞上。Lex可能是Ps的配體，因為用Lex抗體或用包含Lex結(jié)構(gòu)的可溶性寡糖可抑制髓樣細胞、凝血

6、酶激活的血小板及Ps轉(zhuǎn)導(dǎo)的中國倉鼠卵巢（chinese hamster ovary;CHO）細胞的活性。所有這些配體分子均帶負電荷，同時Lucia de BA等4研究表明這些配體并非磷酸肌醇連接蛋白。另外，Moore等5在1992年于中性粒細胞和HL60細胞系中提取出名為PSGL-1（P-selectin glycoprotein ligand-1）的膜糖蛋白，它的結(jié)構(gòu)不同于上述可能配體分子，但它也可促進活化的血小板與中性粒細胞的粘附并產(chǎn)生作用，而抗PSGL-1抗體則可完全阻斷這種作用。2Ps對心肌I/R損傷的影響1989年，Hattori等6提出在炎性介質(zhì)如組胺作用下，內(nèi)皮細胞激活，Ps在數(shù)

7、分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)位至外側(cè)質(zhì)膜，在質(zhì)膜上表達后又快速再內(nèi)在化（reinternalized），再內(nèi)在化的具體作用不清。Ps在從內(nèi)皮細胞內(nèi)部至表面的重新分布，可使血流中的多形核粒細胞（PMN）在內(nèi)皮上滾動，并促進PMN與內(nèi)皮細胞間的粘附從而產(chǎn)生組織損傷。Mayadas等7發(fā)現(xiàn)，在缺乏Ps的小鼠上，人為誘發(fā)感染，未發(fā)現(xiàn)白細胞在腸系膜血管上滾動并延遲其對血管壁的侵入，從而避免感染進一步加重。Seko等8在心肌缺血30min再灌注48h的大鼠在體心臟模型中進行研究，發(fā)現(xiàn)冠狀動脈內(nèi)皮細胞表達Ps增加，同時他們又對血管內(nèi)皮細胞進行體外I/R實驗（缺氧60min復(fù)灌60min），發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞上Ps表達上升，

8、而用選擇素寡肽可有效地減少Ps的表達及大鼠心肌梗死面積。Scalia等8從另一個側(cè)面證實了上述結(jié)論，在豬心臟缺血20min再灌前10min靜注PKC（蛋白激酶C）抑制劑N-N-N環(huán)丙鞘氨醇（TMS）18g/kg有效地減少了以CPK（肌酸激酶）為標志的心肌梗死的發(fā)生及心肌過氧化物的產(chǎn)生；通過免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，TMS有效地減少了內(nèi)皮細胞上Ps的表達；而通過流式細胞儀測定，TMS有效地減少了Ps在血小板上的表達。這提示外源性TMS可作為抑制白細胞與內(nèi)皮細胞、活化血小板粘附，減輕心肌I/R損傷的心臟保護劑。但也有研究表明，Ps對心肌I/R損傷的效應(yīng)與上述研究不同，如Burns等10從mRNA水平研究P

9、s在心肺旁路手術(shù)中的作用，結(jié)果顯示其對心肌I/R損傷作用有限。至于造成這種實驗結(jié)果不一的原因，目前認識不一。一種認為可能與實驗設(shè)計不一致有關(guān)，另一種認為可能與實驗?zāi)Ｐ停ㄈ绮捎萌嘶騽游铮┎灰恢掠嘘P(guān)。3Ps在心肌I/R損傷中的可能機制3.1Ps在血小板或內(nèi)皮細胞上表達上調(diào)：有許多因素可促進Ps在血小板或內(nèi)皮細胞上的表達。Cindy等11提出二磷酸腺苷（ADP）、凝血酶、去甲腎上腺素、膠原可使血小板上Ps表達增加。Patel等12證實炎性介質(zhì)如組胺、氧自由基等促使Ps在內(nèi)皮細胞及血小板上表達增加。Lehr等13證實氧化脂質(zhì)可促使Ps在上述細胞上表達增加；輕度氧化修飾的低密度脂蛋白（ox-LDL）能使

10、內(nèi)皮細胞中的Ps的mRNA合成增加。細胞因子如白細胞介素-4（IL-4）、OSM（oncostatin M）14及腫瘤壞死因子-（TNF-）15等至少在轉(zhuǎn)錄水平促進Ps在血小板及內(nèi)皮細胞上的表達。Flaumenhaft等16指出Ca2+、H+可促進血小板脫顆粒釋放-顆粒，從而使Ps表達在血小板表面，H+促使Ps的表達是非Ca2+依賴的，但無論是Ca2+還是H+，對Ps的影響均需消耗三磷酸腺苷（ATP）。目前認為，在轉(zhuǎn)錄水平，對Ps表達調(diào)控的基因集中在Ps的5'側(cè)區(qū)，由順式元件和其相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同完成17，負責細胞表達基礎(chǔ)水平Ps及在細胞因子等因素作用下迅速誘導(dǎo)表達Ps。TNF-可通過

11、轉(zhuǎn)錄因子NF-B（核因子B）來調(diào)節(jié)細胞表達Ps。在靜息狀態(tài)下，NF-B結(jié)合蛋白以無活性的胞質(zhì)形式存在，稱IB。當細胞受到TNF-刺激時，胞漿中的IB被磷酸化，繼而被降解成有活性的P50/P65、P65/P65異、同二聚體18。上述二聚體進入細胞核內(nèi)與Ps基因中的B位點結(jié)合，參與Ps基因轉(zhuǎn)錄激活過程，誘導(dǎo)細胞增強表達Ps。IL-4、OSM幾乎以相同途徑激活Ps的轉(zhuǎn)錄，兩者與細胞上相應(yīng)受體結(jié)合后，受到細胞因子刺激的受體激活酪氨酸蛋白激酶JAK、TYK，這些激酶可以使胞漿中潛在的轉(zhuǎn)錄因子IL-4 STAT（signal transducer and activator of transcriptio

12、n)/STAT6及與OSM相關(guān)的STAT1、STAT3磷酸化19，磷酸化的STAT進入細胞核中與Ps基因中的反應(yīng)序列結(jié)合（核心空間為TT-AA結(jié)構(gòu)），這樣，兩者誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄，增強細胞表達Ps。而組胺、氧自由基、H2O220等炎性因子可能通過NF-B途徑來促進細胞Ps的表達。在細胞水平，促進Ps表達增加的可能機制如下：（1）在I/R損傷中，氧自由基大量產(chǎn)生，使細胞膜破壞，導(dǎo)致單核巨噬細胞膜上Ps的識別點受損，使其吞噬Ps表達異常增多的血小板功能下降；（2）活化的PMN使本身Ps抑制劑合成減少21；（3）內(nèi)皮細胞受損，使具有抑制Ps表達的內(nèi)皮衍化舒張因子/一氧化氮（EDRF/NO）釋放減少。另外，

13、PKC激活劑phorbol酯可使血小板或內(nèi)皮細胞Ps表達上調(diào)，而用PKC抑制劑TMS、DMS或NO供體可使Ps表達下降，因此PKC可能與Ps上調(diào)有關(guān)。3.2Ps促進細胞間的滾動、粘附及遷移：Steven等22用玫瑰花結(jié)法發(fā)現(xiàn)，當存在1.6mmol/L的Ca2+時，超過60%的白細胞與2個激活的血小板粘附，而不加Ca2+時，和激活的血小板粘附的白細胞數(shù)降至15%左右。這研究表明，在I/R損傷時，Ca2+大量內(nèi)流，它與Ps的NH2端植物素樣區(qū)域的Ca2+結(jié)合位點結(jié)合，改變了Ps的分子形狀，露出了Ps與白細胞結(jié)合的表位，促進血小板或內(nèi)皮細胞上的Ps與白細胞上的配體-寡糖結(jié)構(gòu)如sialyl-Lex結(jié)合

14、，使它們與白細胞進行可逆粘附或使白細胞沿血流方向在內(nèi)皮細胞上滾動23。若單用純化、不活動的Ps與白細胞作用，白細胞形態(tài)未從原先的圓形變得多極和伸展，而且不久白細胞和Ps漸分離。但實際上，完整細胞（血小板或內(nèi)皮細胞）上的Ps與白細胞進行可逆粘附后，白細胞形態(tài)可發(fā)生較多變化，有研究表明這可能與完整細胞表達血小板活化因子（PAF）有關(guān)。激活的血小板不僅表達Ps，而且協(xié)同表達PAF，盡管內(nèi)皮細胞本身不含有PAF，卻在組胺等刺激下協(xié)同Ps合成PAF。Ps與PAF協(xié)同表達可能是一種旁分泌過程24，是Ps通過信息傳遞于與之膜相連（membrane-binding)的PAF，促使PAF也同時分泌。PAF與PM

15、N上的受體相連，該受體通過G-蛋白與細胞內(nèi)Ca2+調(diào)節(jié)系統(tǒng)相聯(lián)系，激活蛋白激酶，從而發(fā)生一系列反應(yīng)25。純化狀態(tài)或表達在模型膜上的PAF能誘導(dǎo)白細胞變形（變得多極）、Ca2+內(nèi)流及促使白細胞上的CD11/CD18上調(diào)24。另外Evangelista等26提出，Ps與相應(yīng)配體PSGL-1結(jié)合后，可激活酪氨酸激酶，接著后者可使PMN上的CD11b/CD18激活，而CD11b/CD18與其相應(yīng)配體結(jié)合，是P110（protein of 110 KD）酪氨酸磷酸化所必需，用酪氨酸激酶抑制劑如genistein可抑制P110的磷酸化，同時也抑制了PMN/血小板之間的聚集。這些均說明CD11/CD18在白

16、細胞上的出現(xiàn)可使白細胞與血小板上的可能受體如ICAM-2、或血小板上的整合素GP（糖蛋白）b/a、GPa、Thrombospondin（凝血酶敏感蛋白）、凝血酶原、纖粘連蛋白等結(jié)合，形成兩者之間牢固、穩(wěn)定的粘附27。另一方面，白細胞與內(nèi)皮細胞的粘附也經(jīng)歷了類似的幾個步驟：（1）白細胞通過Ps和L-選擇素（Ls）在血管內(nèi)皮上滾動；（2）白細胞經(jīng)PAF激活后使2-整合素CD11a/CD18(LFA-1)和CD11b/CD18(Mac-1)上調(diào)；（3）內(nèi)皮細胞上的Ls脫落，通過CD18與內(nèi)皮細胞上的配體ICAM 1、2（細胞間粘附分子1、2）的相互粘附，導(dǎo)致不可逆粘附28。另外，Bombeli等29

17、證實，在某些前炎性（proinflammatory）、前凝血（prothrombotic）狀態(tài)下，內(nèi)皮細胞經(jīng)歷了細胞凋亡（apoptosis），而經(jīng)歷此變的內(nèi)皮細胞易與其它細胞粘附，甚至與未激活的血小板粘附，此間的粘附與-整合素有關(guān)，但Ps是否參與其中則尚未明了。3.3Ps始動的心肌I/R損傷：由上可知，Ps始動了白細胞與血小板、內(nèi)皮細胞間的相互作用，并就此造成了機體的損傷。一方面，白細胞與活化的血小板、內(nèi)皮細胞相互作用，可形成微血栓，阻塞毛細血管，造成無再流現(xiàn)象（no reflowing）；另一方面，白細胞激活后通過Ps與內(nèi)皮細胞粘附，繼之游出血管壁，在此過程中，白細胞將釋放大量毒性反應(yīng)產(chǎn)物

18、如（H2O2、O-2）和各種內(nèi)涵酶（如蛋白酶、水解酶），其中H2O2在髓過氧化物酶催化下與血清氯離子結(jié)合形成次氯酸，次氯酸及各種酶使血管通透性增加30，而后者可造成大量酶的滲出、白細胞游出，白細胞隨之釋放自由基，這些反過來又促進Ps表達，形成級聯(lián)反應(yīng)。這一切使得心肌組織中大血管血流恢復(fù)，但局部微循環(huán)灌注仍存在不足，造成心肌I/R損傷。綜上所述，Ps作為一種細胞粘附分子，具有多種功能，不僅具有識別功能，而且可始動細胞反應(yīng)，并通過旁分泌機制協(xié)同分泌PAF，使細胞間作用從可逆粘附至牢固粘附，最后使白細胞遷出血管，造成心肌炎癥和栓塞，導(dǎo)致心肌I/R損傷。對于Ps結(jié)構(gòu)、功能的全面認識將有助于防治心血管疾

19、病，尤其是提高急性心梗后溶栓、經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈成形術(shù)（PTCA）、體外循環(huán)等治療的安全性和可靠性，具有非同一般的意義。應(yīng)淑琴（浙江大學醫(yī)學院附屬二院心內(nèi)科，浙江杭州310009）單江（浙江大學醫(yī)學院附屬二院心內(nèi)科，浙江杭州310009）徐耕（浙江大學醫(yī)學院附屬二院心內(nèi)科，浙江杭州310009） 參 考 文 獻 1Stenberg PE,McEver RP,Shuman MA,et al.A Platelet 2-granule membrane protein(GMP-140) is expressed on the plasma membrane after activationJ.J Ce

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