不同樣品核酸熒光定量PCR完美解決方案

1、不同樣品核酸提取不同樣品核酸提取、擴增擴增、熒光定量PCR 完美解決方案北京百泰克生物技術(shù)有限公司北京百泰克生物技術(shù)有限公司(北京市海淀區(qū)上地信息路北京市海淀區(qū)上地信息路151515號號Fax :010-*不同樣品核酸提取不同樣品核酸提取、擴增擴增、熒光定量PCR 完美解決方案-核酸提取攻略核酸提取攻略北京百泰克生物技術(shù)有限公司北京百泰克生物技術(shù)有限公司(北京市海淀區(qū)上地信息路北京市海淀區(qū)上地信息路151515號號不同樣品不同樣品RNA RNA RNA提取最適方法提取最適方法 RNA RNA純度與質(zhì)量考察純度與質(zhì)量考察RNA RNA提取常見問題及解決方案提取常見問題及解決方案內(nèi)容概要常見樣品常

2、見樣品DNA DNA DNA提取提取特殊樣品特殊樣品DNA DNA DNA提取提取DNA DNA分離純化中常見問題分析分離純化中常見問題分析樣品裂解液液氮研磨抽提離心洗滌酒精沉淀或介質(zhì)吸附RNA 提取流程上層溶液或其他方法處理細(xì)胞裂解干燥溶解或洗脫沉淀法沉淀法:異丙醇或乙醇 介質(zhì)吸附法介質(zhì)吸附法:RNA 提取常用方法-沉淀方法吸附材料原理硅基質(zhì)高鹽低pH值結(jié)合核酸,低鹽高pH值洗脫陰離子交換樹脂低鹽高pH值結(jié)合核酸,高鹽低pH值洗脫磁珠磁性微粒掛上不同基團(tuán)可吸附并攜帶RNA異硫氰酸胍異硫氰酸胍/苯酚法在變性劑異硫氰酸胍的作用下,細(xì)胞被裂解,同時核蛋白體上的蛋白變性,核酸釋放;釋放出來的DNA和

3、RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分別RNA 提取常用方法-裂解方式位于整個體系中的中間相和水相,從而得以分離; 有機溶劑抽提,沉淀,得到純凈RNA。胍鹽/-巰基乙醇鹽酸胍裂解樣本,抑制RNase 的活性; -巰基乙醇變性蛋白BioTeke的RNA提取試劑具有明顯的優(yōu)勢不斷升級。在經(jīng)典試劑的基礎(chǔ)上,不斷升級在經(jīng)典試劑的基礎(chǔ)上提取試劑:多款高品質(zhì)的RNA提取試劑Tri pure (Trizol法的升級產(chǎn)品RNApure(Trizol法的升級產(chǎn)品組織組織/細(xì)胞樣品細(xì)胞樣品RNA RNA RNA提取提取 材料材料:小鼠肝臟組織方法方法:BioTeke RNApure 高純總RNA快速提取試劑盒0.

4、1g 樣品組織 結(jié)果結(jié)果:圖:小鼠肝臟組織小鼠肝臟組織RNA RNARNA快速提取試劑快速提取試劑RNA高純總RNARNApure 高純總高純總RNApure 圖片說明:1 BioTeke RNAclean2 BioTeke TRIpure (TRIzol法3 BioTeke RNApure 離心柱型(注:本圖實驗材料為植物葉片同一樣品基因組DNA 和RNA 分提原理原理: 根據(jù)基因組DNA 和RNA 在硅基質(zhì)膜上的結(jié)合條件不同,用兩根離心吸 附柱分別提取基因組DNA 和RNA 。-血液血液特殊樣品提取-特殊樣品RNA提取RNARNA提取 圖1全血樣品溶解在TRIpure LSReagent試

5、劑后的狀態(tài)圖2泳道1與2,在-80度保存一個月后的提 取結(jié)果。M泳道:標(biāo)準(zhǔn)的Hela細(xì)胞RNA 材料材料:松針?biāo)舍槨⒍喽?、香蕉香蕉、木菠蘿和楊樹方法方法:通用植物總多糖多酚植物樣品多糖多酚植物樣品RNA RNA RNA的提取的提取RNA 提取試劑盒(離心柱型離心柱型0.1g 樣品組織結(jié)果結(jié)果:得率得率:約3535-40g圖片說明圖片說明:1、2 2 楊樹楊樹楊樹;3、4 4 香蕉香蕉香蕉;5、6 6 松針?biāo)舍標(biāo)舍?7、8 8 冬青冬青冬青;9 9 、10 10 木菠蘿木菠蘿1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Micro RNA Micro RNA提取提取1 2 3 4提取原理提取原理:

6、傳統(tǒng)方法:先提取總RNA然后跑膠回收或沉淀Micro RNA。新方法:通過裂解液裂解和酸酚分層后過柱兩次,一次去除基因組DNA和大片段RNA,圖片說明:1、2DNA 和大RNA ;3、4Micro RNA(材料為小鼠肝臟組織后一次吸附Micro RNA,然后漂洗收集。新方法特點新方法特點:高效分離小RNA,同時分離總RNA 可用于miRNA、siRNA和snRNA的分析 適用各種來源的樣品提取時間短,約30分鐘完成實驗生物大分子具有共軛雙鍵生物大分子具有共軛雙鍵,在260260和和280nm 280nm波長處有光吸收波長處有光吸收峰。純度純度:紫外分光光度計測定所提總紫外分光光度計測定所提總R

7、NA RNA RNA在在260nm 260nm和和280nm 280nm波長波長RNA RNA純度與質(zhì)量考察純度與質(zhì)量考察處的光吸收處的光吸收,以A260/A280A260/A280的比值來判斷總的比值來判斷總的比值來判斷總RNA RNA RNA的純度的純度的純度。質(zhì)量:甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定。RNA RNA提取常見問題及解決方案提取常見問題及解決方案RNA RNA 的降解的降解OD260 /OD280 OD260 /OD280 比值偏低比值偏低 電泳帶型異常下游實驗效果不佳RNA 的降解新鮮細(xì)胞或組織新鮮細(xì)胞或組織:裂解液的質(zhì)量外源RNase的污染裂解液的用量不

8、足 組織裂解不充分另外某些富含內(nèi)源酶的樣品(如脾臟,胸腺等,很難避免RNA 的降解。 建議在液氮條件下將組織碾碎,并且勻漿時使用更多裂解液。RNA 的降解冷凍樣品冷凍樣品:樣品取材后應(yīng)立即置于液氮中速凍,然后可以移至-70冰箱保存。樣品要相對小一點; 先用液氮研磨,再加裂解液勻漿; 樣品與裂解液充分接觸前避免融化,研磨用具必須預(yù)冷,研磨過程中及時補充液氮。RNA 的保護(hù)采集樣品的保護(hù)采集樣品的保護(hù):通常用液氮保存樣品保護(hù)劑RNAfixer,樣品浸泡其中可以在37保存一天,25一周,4一個月,-20一年左右。環(huán)境中環(huán)境中RNase RNase RNase的清除的清除的清除:DEPC處理各種實驗器

9、具 RNAsafe對溶液中RNase進(jìn)行清除。 RNA酶噴霧清除劑,可對固體表面的RNase起到清除的作用,更大程度上避免RNase的污染。蛋白質(zhì)污染蛋白質(zhì)污染:不要吸入中間層及有機相,加入氯仿后首先混勻,并且離心分層的離心力和時間要足夠。 減少起始樣品量,確保裂解完全、徹底OD260 /OD280 比值偏低 解決辦法:重新抽提一次,再沉淀,溶解。苯酚殘留苯酚殘留:不要吸入中間層及有機相,加入氯仿后首先混勻,并且離心分層的離心力和時間要足夠。 解決辦法:重新抽提一次,再沉淀,溶解。OD260 /OD280 比值偏低抽提試劑殘留抽提試劑殘留:確保洗滌時要徹底懸浮RNA,并且徹底去掉75% 乙醇。

10、 解決辦法:再沉淀一次后,溶解。設(shè)備限制設(shè)備限制:測定OD260 及OD280 數(shù)值時,要使OD260 讀數(shù)在0.10 -0.50 之間。此范圍線性最好。用水稀釋樣品用水稀釋樣品:測OD 時,對照及樣品稀釋液請使用10 mM Tris,pH 7.5。用水作為稀釋液將導(dǎo)致比值的降低。非變性電泳非變性電泳:上樣量超過3g,電壓超過6V/cm,電泳緩沖液陳舊,均可能導(dǎo)致28S 和18S 條帶分不開。變性電泳條帶變淡變性電泳條帶變淡:電泳條帶異常EB 與單鏈的結(jié)合能力要差一些,故同樣的上樣量,變性電泳比非變性電泳要淡一些;甲醛的質(zhì)量不高。抽提試劑的殘留75% 乙醇洗滌樣品中雜質(zhì)的殘留下游實驗效果不佳(

11、下游實驗效果不佳(RNA RNA降解降解降解 多糖等雜質(zhì),再次沉淀DNA DNA 污染污染使用RNase-Free 的DNase I 消化抽提RNA不同樣品基因組不同樣品基因組DNA DNA DNA提取提取 常見樣品基因組常見樣品基因組DNA DNA DNA提取提取細(xì)胞細(xì)胞/組織組織/細(xì)菌細(xì)菌/血液基因血液基因DNA DNA DNA提取提取 植物材料植物材料DNA DNA DNA提取提取特殊樣品基因組特殊樣品基因組DNA DNA DNA提取提取大量血液樣品大量血液樣品DNA DNA DNA提取提取環(huán)境微生物環(huán)境微生物DNA DNA DNA提取提取 臨床樣本臨床樣本DNA DNA DNA提取提取

12、DNA DNA分離純化中的常見問題分析分離純化中的常見問題分析基因組基因組DNA DNA DNA提取流程提取流程 化學(xué)方法CTAB法:適用于植物材料等。是一種陽離子去污劑,溶解細(xì)胞膜,與核酸結(jié)合。在高鹽下溶解釋放DNA。 SDS法:適用于血液,細(xì)胞,動物組織,細(xì)菌,酵母等物理方法基因組基因組DNA DNA DNA提取流程提取流程提取流程-細(xì)胞裂解 機械剪切,超聲波破碎,研磨勻漿等。易造成DNA斷裂。 酶法蛋白酶KBioTeke BioTeke基因組基因組基因組DNA DNA DNA提取系列試劑盒綜合利用上述方法提取系列試劑盒綜合利用上述方法 提取原理:提取原理:組織組織/細(xì)胞細(xì)胞/細(xì)菌細(xì)菌/血

13、液基因組血液基因組DNA DNA DNA提取提取特點:特點:不需要使用有毒的氯仿、苯酚等試劑多次柱漂洗確保高純度;長度可達(dá)30-50Kb 提取原理:提取原理:植物材料基因組植物材料基因組DNA DNA DNA提取提取玉米葉片基因組玉米葉片基因組DNA DNA DNA提取提取(使用新型快速植物基因組使用新型快速植物基因組DNA DNA DNA提取試劑盒提取試劑盒提取試劑盒特殊樣品基因組特殊樣品基因組DNA DNA DNA提取提取傳統(tǒng)方法適用于所有材料基因組DNA的提取?比如大量血液比如大量血液?比如土壤/比如土壤/糞便中的微生物基因組糞便中的微生物基因組DNA DNA DNA的提取的提取的提取?

14、比如病毒及其他微量樣品比如病毒及其他微量樣品DNA DNA DNA的提取的提取的提取?NO NO!中量中量/大量血液基因組大量血液基因組DNA DNA DNA提取提取傳統(tǒng)方法消化后,用酚消化后,用酚/氯仿抽提,時間長,損害操作人員健康BioTeke BioTeke創(chuàng)新創(chuàng)新不用蛋白酶消化不用酚不用酚/氯仿抽提結(jié)果結(jié)果:5ml 5ml全血基因組全血基因組全血基因組DNA DNA DNA提取電泳結(jié)果提取電泳結(jié)果土壤土壤/糞便微生物基因組糞便微生物基因組DNADNADNA提取提取其他品牌試劑盒存在缺點:采用玻璃珠或鋼珠破碎,導(dǎo)致基因組斷裂嚴(yán)重;必須購買破碎專用設(shè)備,增加使用成本;采用包括玻璃奶、離心吸

15、附柱串聯(lián)的純化方式,導(dǎo)致DNA大量損失,得率很低,很難真實反映土壤微生物的多樣性。BioTeke的技術(shù)創(chuàng)新:采用酶法破碎,保證基因組的完整性;用異丙醇沉淀DNA,DNA無損失。廠家破碎方式純化方式提取時間是否需要專門設(shè)備BioTeke酶法破碎基因組完整離心柱吸附雜質(zhì)純度高1小時內(nèi)不需要Q公司鋼珠破碎基因組斷裂玻璃奶同離心柱結(jié)合得率低2小時需要M公司玻璃珠破碎基因組斷裂離心柱純化得率較低2小時需要提取DNA提取DNA臨床樣品基因組DNA臨床樣品基因組病毒基因組DNA提取酵母基因組DNA提取口腔拭子DNA提取微量樣品DNA提取石蠟組織DNA提取頭發(fā)DNA提取提取擴增一步法DNA提取擴增DNA一步法

16、DNA原理: 綜合微量樣品基因組DNA提取和高效的PCR擴增試劑。從毛發(fā)、石蠟組織等微量組織中高效提取足夠 濃度的DNA,然后進(jìn)行PCR擴增。操作簡單、方便,可對大量樣品同時進(jìn)行操作。保證基因組保證基因組DNA DNA DNA的完整性和純度的完整性和純度 提高提高DNA DNA DNA的洗脫效率的洗脫效率基因組基因組DNA DNA DNA分離純化中的注意事項分離純化中的注意事項 DNA DNA的儲存的儲存保證基因組保證基因組DNA DNA DNA的完整性和純度的完整性和純度提高提高DNA DNA DNA的洗脫效率的洗脫效率基因組基因組DNA DNA DNA分離純化中的注意事項分離純化中的注意事

17、項簡化操作步驟,縮短操作時間DNA DNA的儲存的儲存減少物理因素對DNA的降解,震蕩、攪拌等減少化學(xué)物質(zhì)對DNA的降解,操作多在pH4-10防止基因組DNA的生物降解:DNase保證基因組保證基因組DNA DNA DNA的完整性和純度的完整性和純度提高提高DNA DNA DNA的洗脫效率的洗脫效率基因組基因組DNA DNA DNA分離純化中的注意事項分離純化中的注意事項洗脫液65度預(yù)熱10分鐘DNA DNA的儲存的儲存洗脫體積不小于30L 洗脫2次或者3次保證基因組保證基因組DNA DNA DNA的完整性和純度的完整性和純度提高提高DNA DNA DNA的洗脫效率的洗脫效率基因組基因組DNA

18、 DNA DNA分離純化中的注意事項分離純化中的注意事項可長期儲存于pH=7.0的ddH 2O或TE DNA DNA的儲存的儲存不易制成干品儲存分裝低溫保存不同樣品核酸提取、不同樣品核酸提取、擴增擴增、熒光定量PCR 完美解決方案-Real-time qPCR 攻略北京百泰克生物技術(shù)有限公司北京百泰克生物技術(shù)有限公司(北京市海淀區(qū)上地信息路北京市海淀區(qū)上地信息路151515號號主要內(nèi)容RT-PCR原理應(yīng)用Real-time qPCR原理及應(yīng)用Real-time qPCR成功關(guān)鍵Real-time qPCR數(shù)據(jù)分析Real-time qPCR常見問題及解決方案中心法則與中心法則與RT RT RT

19、、PCR DNAPCRRNART逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以以隨機引物、oligo(dT或基因特異性的引物(GSP起始。提取RNA的質(zhì)量會影響到RT的產(chǎn)量及反轉(zhuǎn)錄原理cDNA的完整性。整個過程要求無RNA酶操作。 反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑都會對產(chǎn)物的質(zhì)量造成一定的影響。One step RT-PCR實驗對比One step RT模板:使用BioTeke公司的RNApure 總RNA提取試劑盒提取的雞肝臟組織RNA 目的片段:目的片段:管家基因-Actin反應(yīng)體系:體系:反應(yīng)程序程序:PCR PCR反應(yīng)原理本質(zhì)反應(yīng)原理本質(zhì)反應(yīng)原理本質(zhì):酶促反應(yīng)材料材料:模板模板、引物引物、四種四種dNTP dNTP dNTP

20、和和DNA DNA聚合酶聚合酶原理步驟步驟:高溫變性高溫變性、低溫退火低溫退火、適溫延伸 多次反復(fù)循環(huán)多次反復(fù)循環(huán),DNA DNA 以指數(shù)方式擴增以指數(shù)方式擴增影響因素PCR影響因素PCR引物Taq DNA polymerase鎂離子濃度dNTP 濃度循環(huán)參數(shù)甲酰胺酶的差別主要酶的差別主要: 特異性DNA DNA聚合酶選擇是聚合酶選擇是聚合酶選擇是PCR PCR PCR成功的關(guān)鍵成功的關(guān)鍵類別酶特性擴增長度2k/格保真性 1 /格Taq 保真性耐熱性擴增效率擴增長度Taq plusLA-Taq pfuPower Taq DNA polymerase :普通聚合酶Power Taq plus DNA polymerase:保真較高的