丹酚酸B體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究

1、丹酚酸B體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究                                   作者：徐秀梅，郭茂娟 趙旭 范英昌【摘要】  目的觀察丹酚酸B(SalB)干預(yù)體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)分化為心

2、肌樣細(xì)胞的作用及其機(jī)制。方法分離培養(yǎng)及鑒定大鼠MSCs，對(duì)其進(jìn)行分組誘導(dǎo):SalB組(終濃度為250 g/L)、5-氮胞苷組(終濃度為10 mol/L)、SalB聯(lián)合5-aza組(終濃度分別為250 g/L與10 mol/L)，誘導(dǎo)24 h后繼續(xù)培養(yǎng)4周，觀察其形態(tài)學(xué)變化，免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定心肌特異性肌鈣蛋白T (cTnT)的表達(dá), 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測(cè)心肌早期基因NKX2.5、GATA-4、Desmin和a-actin mRNA的表達(dá)。結(jié)果誘導(dǎo)后的MSCs體積增大，增殖減慢，并出現(xiàn)肌管樣結(jié)構(gòu)；免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示誘導(dǎo)后的MSCs表達(dá)心肌特異性蛋白cTnT，與5-aza組相比，Sal

3、B組cTnT表達(dá)較低，SalB聯(lián)合5-aza組cTnT表達(dá)升高；實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示各組均表達(dá)心肌分化早期基因，SalB聯(lián)合5-aza組誘導(dǎo)后的MSCs的心肌早期分化基因表達(dá)明顯高于其他兩組。結(jié)論SalB可在體外誘導(dǎo)大鼠MSCs定向分化為心肌樣細(xì)胞，其與5-aza聯(lián)合誘導(dǎo)可明顯提高M(jìn)SCs向心肌細(xì)胞分化的能力。 【關(guān)鍵詞】  丹酚酸B； 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞； 體外誘導(dǎo)； 免疫細(xì)胞化學(xué)； 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)系自體來(lái)源,取材容易,擴(kuò)增能力強(qiáng),是一種體內(nèi)外均有極強(qiáng)的分化潛能的干細(xì)胞1。1995年，Wakitanis等2發(fā)現(xiàn)體外分離培養(yǎng)的大鼠MSC

4、s體外可被5-aza誘導(dǎo)分化為心肌樣細(xì)胞。但5-aza作為抗腫瘤藥物具有一定的毒副作用,故尋找安全、有效的誘導(dǎo)劑應(yīng)是目前的重要課題。我們前期的研究結(jié)果表明SalB可以減小心肌梗塞的面積3，并能有效地促進(jìn)梗塞灶內(nèi)成纖維細(xì)胞的增生，加速心臟的修復(fù)過(guò)程。那么，它對(duì)有心肌分化潛能的MSCs起什么作用呢？為進(jìn)一步研究其機(jī)制，我們進(jìn)行了中藥單體丹酚酸B(SalB)體外誘導(dǎo)MSCs分化為心肌樣細(xì)胞的研究?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。1  器材1.1  動(dòng)物 （200±20）g體重的Wistar雄性大鼠，購(gòu)于醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：scxk2005-0

5、001。1.3 藥品 5-aza，Sigma公司；丹酚酸B，天津天士力制藥股份有限公司。2 方法2.1  MSCs的分離培養(yǎng)將大鼠脫頸處死，無(wú)菌條件下取雙側(cè)股骨、脛骨，適量D-Hank's液沖洗骨髓，100目篩網(wǎng)過(guò)濾，將密度為1.073g/ml的Percoll預(yù)先置于試管的底部,然后按照11的比例沿管壁緩慢滴加骨髓懸液，離心（1 800 r/min,20 min），收獲位于界面層灰白色的單個(gè)核細(xì)胞,用L-DMEM離心洗滌2次（800 r/min,5 min）后接種于完全培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、100 mg/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的L-DMEM培養(yǎng)液），置

6、于37、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后首次換液，以后每3 d更換1次培養(yǎng)液，2周后細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底。2.2 MSCs的傳代及純化 待原代MSCs長(zhǎng)滿瓶底時(shí)，用11配比的0.25%胰蛋白酶和0.02%的EDTA對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化23   min，以完全培養(yǎng)液中止消化并反復(fù)吹打貼壁細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液,按13進(jìn)行傳代培養(yǎng)，直至貼壁細(xì)胞彼此融合鋪滿瓶底時(shí),重復(fù)上述操作,反復(fù)傳至第9代。2.3 MSCs的鑒定選用生長(zhǎng)狀況良好的第9代 MSCs，用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD44和CD34。將第9代的大鼠MSCs培養(yǎng)于6孔板，孔板內(nèi)預(yù)置無(wú)菌蓋玻片，周后，細(xì)

7、胞80%長(zhǎng)滿瓶底，用95%乙醇（加少量冰醋酸）固定15 min，PBS徹底清洗。滴加5%BSA封閉液，室溫孵育20 min，甩去多余液體，不洗。滴加以1100濃度稀釋的一抗（兔IgG）4過(guò)夜。余按SABC免疫組化試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。蘇木素輕度復(fù)染、脫水、透明、封片。2.4 MSCs的誘導(dǎo)分化將第9代MSCs接種于預(yù)先置有蓋玻片的6孔板中，培養(yǎng)2 d，將完全培養(yǎng)液換為無(wú)血清培養(yǎng)液，24h后進(jìn)行分組誘導(dǎo)：SalB組(終濃度為250 g/L)、5-aza組(終濃度為10 mol/L)、SalB聯(lián)合5-aza組(終濃度分別為250 g/L，10 mol/L)，并設(shè)空白對(duì)照組,僅用基本培養(yǎng)液(L-DME

8、M)誘導(dǎo)。誘導(dǎo)劑作用24 h后，更換完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d換液1次，共4周。2.5 免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定心肌特異性蛋白cTnT取誘導(dǎo)后4周的細(xì)胞，用95乙醇（加少量冰醋酸）固定15 min，PBS徹底清洗。用羊血清封閉，滴加cTnT(150)，陰性對(duì)照用PBS代替一抗cTnT，4冰箱過(guò)夜。其余步驟按超敏S-P試劑盒操作程序進(jìn)行，最后蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，中性樹脂封固。顯微鏡下觀察，胞質(zhì)中有棕黃色顆粒的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞。每組選取染色較好的8張玻片，在顯微鏡下每張玻片取5個(gè)視野，由數(shù)碼攝像機(jī)攝入，用Image Pro Plus6.0圖像分析軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。2.6 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢

9、測(cè)心肌早期基因NKX2.5、GATA-4、Desmin和a-actin mRNA的表達(dá)  取誘導(dǎo)后4周的細(xì)胞，按以下步驟進(jìn)行操作：(1)RNA提取與cDNA的合成:取誘導(dǎo)后4周的細(xì)胞，采用Trizol一步法提取總RNA，按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄條件為：2510，4830，955 min。(2)實(shí)時(shí)PCR法檢測(cè)心肌早期基因NKX2.5，GATA-4，Desmin和a-actin的相對(duì)表達(dá)量：從NCBI基因庫(kù)查找、驗(yàn)證后，確定各目的基因和管家基因的引物序列，由北京賽百勝基因有限公司合成，引物序列見表1。根據(jù)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95，10 min；95，15sec60，1

10、 min，40循環(huán)。（3）所得CT值經(jīng)轉(zhuǎn)換后以2-CT相對(duì)定量法獲得每個(gè)樣本各目的基因相對(duì)表達(dá)量的數(shù)值。表1  各目的基因及內(nèi)參照基因引物序列（略）2.7  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法結(jié)果用±s表示。應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，以P0.05為具有統(tǒng)計(jì)差異。1         3  結(jié)果3.1  MSCs的形態(tài)特征 剛分離接種的MSCs鏡下呈圓形，大小不一，數(shù)目較多，24 h內(nèi)貼壁完成，但仍有較多的圓形細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中，23 d后細(xì)胞呈梭

11、形，體積較懸浮的圓形細(xì)胞大，大小較均一，核漿分界清楚，折光性強(qiáng)。89 d形成多個(gè)克隆，細(xì)胞排列有一定方向性，多成“漩渦狀”或“網(wǎng)狀”生長(zhǎng)。傳代細(xì)胞保持原代細(xì)胞的形態(tài)特征，24 h內(nèi)完全貼壁，呈梭形，增殖迅速，57 d即鋪滿培養(yǎng)瓶底部，發(fā)生接觸抑制不再生長(zhǎng)，需及時(shí)傳代。在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，通過(guò)換液可去除不貼壁的紅細(xì)胞，通過(guò)傳代可去除貼壁比較牢固的巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等，隨著傳代，細(xì)胞得到純化。3.2  MSCs表面抗原的鑒定 鏡下可見陽(yáng)性細(xì)胞胞漿內(nèi)含棕黃色、顆粒狀物質(zhì)。永生化的MSCs免疫組化染色CD44表達(dá)陽(yáng)性，不表達(dá)CD34。3.3  MSCs誘導(dǎo)后的形態(tài)變化

12、60;陰性對(duì)照組細(xì)胞在誘導(dǎo)1周后基本長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底，而各誘導(dǎo)組細(xì)胞死亡較多。2周后，陰性對(duì)照組的細(xì)胞因生長(zhǎng)抑制開始死亡，細(xì)胞重疊生長(zhǎng)，狀態(tài)不佳；誘導(dǎo)組細(xì)胞仍有少量死亡，但部分細(xì)胞體積開始變大，形態(tài)呈梭形、長(zhǎng)方形、不規(guī)則形；3周后，陰性對(duì)照組的細(xì)胞大片死亡，鏡下形態(tài)不清；各誘導(dǎo)組細(xì)胞呈梭形、長(zhǎng)方形的細(xì)胞數(shù)量相對(duì)增多，細(xì)胞增殖能力減弱，數(shù)量較誘導(dǎo)前減少，個(gè)別胞漿中可見明顯顆粒狀物質(zhì)，部分視野可見肌管樣結(jié)構(gòu)；第4周，陰性對(duì)照組的細(xì)胞形態(tài)模糊；各誘導(dǎo)組細(xì)胞形態(tài)均一，細(xì)胞間發(fā)生融合，排列具有方向性，更多視野可以觀察到明顯的肌管樣結(jié)構(gòu)，以SalB聯(lián)合5-aza組最為明顯。3.4 誘導(dǎo)后MSCs的免疫細(xì)胞化學(xué)

13、鑒定 未誘導(dǎo)的MSCs空白對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)cTnT陽(yáng)性細(xì)胞, SalB，5-aza，SalB聯(lián)合5-aza誘導(dǎo)的各組中cTnT免疫細(xì)胞化學(xué)染色均可見陽(yáng)性細(xì)胞,與5-aza相比，SalB聯(lián)合5-aza組的cTnT表達(dá)明顯增加，陽(yáng)性表達(dá)率為28.21%，單純SalB組的陽(yáng)性表達(dá)率較低。結(jié)果見表2。3.5 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)心肌早期基因NKX2.5、GATA-4、Desmin和a-actin mRNA的表達(dá)結(jié)果顯示，各組均表達(dá)心肌分化早期基因，SalB聯(lián)合5-aza組誘導(dǎo)后的MSCs心肌早期分化基因表達(dá)明顯高于其他兩組（見表3）。誘導(dǎo)后各基因的溶解曲線和擴(kuò)增曲線見圖110。表2

14、60; 各誘導(dǎo)組MSCs的cTnT陽(yáng)性表達(dá)率比較(略) 表3  3組NKx2.5，GATA-4，Desmin，a-actin mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較(略)4 討論    隨著MSCs分離、培養(yǎng)和純化技術(shù)的不斷和成熟，越來(lái)越多的研究者關(guān)注于誘導(dǎo)其定向分化為所需的細(xì)胞，其中處于心臟細(xì)胞與組織再生工程領(lǐng)域的人們正熱衷于誘導(dǎo)其向心肌細(xì)胞分化的研究。Liu等4實(shí)驗(yàn)表明，原代和第1代的MSCs用不同濃度的5aza單次或多次誘導(dǎo)后均未出現(xiàn)心肌樣細(xì)胞，證明未永生化的MSCs在體外是不能分化為心肌細(xì)胞的。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)連續(xù)傳代4個(gè)月以后得到永生型細(xì)胞(immorta

15、lized cells),即純化的間質(zhì)干細(xì)胞5。未分化的永生化MSCs對(duì)誘導(dǎo)成功很關(guān)鍵。因此，本課題組選用了第9代的MSCs。    5-aza是研究最多的干細(xì)胞分化體外誘導(dǎo)劑，也是目前較公認(rèn)的可以誘導(dǎo)MSCs分化為心肌細(xì)胞的藥物。5aza是一種胞苷類似物，能引起DNA中某些胞嘧啶去甲基化，而DNA的甲基化與基因表達(dá)密切相關(guān)。所謂甲基化是指細(xì)胞通過(guò)一個(gè)甲基集團(tuán)與CPG二核苷酸的胞嘧啶環(huán)的5'-末端共價(jià)結(jié)合以修復(fù)基因，一般近70%的CPG殘基被甲基化，甲基化的結(jié)果是這些基因不被表達(dá)，而那些非甲基化的基因表達(dá)。在胚胎發(fā)育早期，特異性基因選擇性的去甲基化使細(xì)胞向

16、不同方向分化6。我們的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了5-aza可以誘導(dǎo)永生化的MSCs向心肌細(xì)胞分化。    肌鈣蛋白（Tn）包含了3種成分：肌鈣蛋白C(TnC)、肌鈣蛋白I(TnI)和肌鈣蛋白T(TnT)。他們?cè)跈M紋肌和心肌的收縮調(diào)節(jié)中起重要作用。肌鈣蛋白T(cTnT)是肌鈣蛋白的原肌球蛋白的粘合亞型，與肌動(dòng)球蛋白上的決定ATP酶活性的Ca2+的敏感性有關(guān)。存在于快慢骨骼肌及心肌亞型中。cTnT在心肌與骨骼肌上的氨基酸序列是不同的,兩者在結(jié)構(gòu)上和免疫方面也有很大的區(qū)別,其抗血清的交叉反應(yīng)率只有1%2%,不易受骨骼肌的影響，是鑒定心肌細(xì)胞的比較特異性的蛋白。因此，本實(shí)驗(yàn)選其作為鑒定M

17、SCs向心肌細(xì)胞分化的重要檢測(cè)指標(biāo)。結(jié)果顯示除陰性對(duì)照組外，各組均表達(dá)cTnT。為探討確切機(jī)制我們從基因水平做了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。研究認(rèn)為，分化信號(hào)提供給MSCs后，引起調(diào)控MSCs分化的關(guān)鍵基因表達(dá)改變，決定了干細(xì)胞的定向分化方向7，8。目前已發(fā)現(xiàn)的與心臟發(fā)育相關(guān)的基因有很多，我們選擇的是目前比較公認(rèn)和研究較多的心肌早期分化基因Nkx2.5、GATA-4、Desmin和a-actin。NKX2.5、GATA-4是對(duì)心臟早期發(fā)育具有至關(guān)重要作用的轉(zhuǎn)錄因子9，10。Nkx2.5基因在心臟中特異表達(dá)，在胚胎、胎兒心肌細(xì)胞中保持一定的表達(dá)水平，是心臟前體細(xì)胞分化的最早期標(biāo)志之一。GATA-4作為GATA

18、轉(zhuǎn)錄因子家族成員，具有兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域，在心臟中特異性表達(dá)，最初表達(dá)于原始心肌中層，然后在血管和心臟內(nèi)膜及肌層中表達(dá)，它除了直接參與調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)基因和相關(guān)調(diào)控基因的表達(dá)外，還可與幾種心肌基因調(diào)控區(qū)的DNA結(jié)合，參與心肌細(xì)胞的分化過(guò)程。NKX2.5、GATA-4在心肌細(xì)胞發(fā)育的早期即出現(xiàn)表達(dá)，兩者單獨(dú)或協(xié)同作用可促進(jìn)正常心肌細(xì)胞的特化、分化和成熟。Desmin和-actin都是細(xì)胞的骨架蛋白。Desmin作為心肌細(xì)胞分化的一種早期的標(biāo)志已經(jīng)得到公認(rèn)，是最早表達(dá)于未分化的肌母細(xì)胞中的肌源性蛋白11，在肌源性細(xì)胞的發(fā)育、成熟過(guò)程中起重要作用，能夠維持肌纖維形態(tài)、連接細(xì)胞核與細(xì)胞膜而使肌小節(jié)之間發(fā)生

19、信號(hào)聯(lián)系。-actin為肌動(dòng)蛋白的一種亞型，是骨骼肌和心肌的特異性具有收縮功能的細(xì)胞骨架蛋白，為胎兒或新生兒心室肌的主要成分。因此Desmin和-actin的表達(dá)陽(yáng)性說(shuō)明MSCs發(fā)生了肌源性分化。心肌細(xì)胞的發(fā)育是一個(gè)連續(xù)的過(guò)程，其中涉及多種基因的參與和調(diào)控，這些基因的表達(dá)及它們之間的相互作用在心肌發(fā)育過(guò)程中至關(guān)重要。據(jù)報(bào)道12，SalB能改善心肌梗塞大鼠的心臟功能,并能使心肌基因表達(dá)譜發(fā)生改變。本研究從體外初步探討了SalB誘導(dǎo)MSCs分化為心肌樣細(xì)胞的機(jī)理，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們認(rèn)為SalB誘導(dǎo)MSCs向心肌細(xì)胞分化的可能機(jī)制一方面是由于SalB作用于MSCs后分泌某些有利于心肌細(xì)胞生長(zhǎng)的因子，從而影響了其向心肌細(xì)胞分化的相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)；另一方面可能是由于其上調(diào)了心肌分化相關(guān)基因的表達(dá)。但是SalB誘導(dǎo)MSCs