NO、NOS與缺血再灌注損傷的研究進(jìn)展

1、NO、NOS與缺血再灌注損傷的研究進(jìn)展    關(guān)鍵詞： 一氧化氮；一氧化氮合酶；缺血再灌注損傷 摘要 一氧化氮及一氧化氮合酶對(duì)缺血再灌注損傷有重要的影響，但有關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的結(jié)論卻相反，這與各實(shí)驗(yàn)觀察的動(dòng)物種類、實(shí)驗(yàn)條件及時(shí)相點(diǎn)不同有關(guān)。有必要作進(jìn)一步的研究。    關(guān)鍵詞一氧化氮；一氧化氮合酶；缺血再灌注損傷    近年來一氧化氮（NO）及一氧化氮合酶（NOS）對(duì)缺血再灌注損傷的效應(yīng)引起人們的廣泛關(guān)注，本文就其在缺血再灌注過程中的研究現(xiàn)狀作一綜述。 依賴于NOS的NO生物合成

2、NOS的分類、分布及調(diào)節(jié) NOS分為兩類，即原生型NOS（constitutive nOS,cNOS）和誘生型NOS（inducible NOS，iNOS）。對(duì)其分子水平研究顯示源于內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)原的表達(dá)產(chǎn)生基因序列并不一樣，但其活性均依賴于鈣離子和鈣調(diào)蛋白，故又將其分為神經(jīng)原性NOS（ncNOS）和內(nèi)皮細(xì)胞NOS（ecNOS0）。iNOS的生物活性不依賴于鈣及鈣調(diào)蛋白，一般情況不表達(dá)?？杀灰恍┘?xì)胞因子如白介素-1（IL-1），腫瘤壞死因子（TNF）誘導(dǎo)激活。雖然三種NOS的基因編碼不同，但結(jié)構(gòu)有相似性，因而功能上也存在相似性1。 三種NOS除主要分布于胞漿的可溶性成分外，也存在于一些亞細(xì)胞器

3、中2，不同的組織可有同一種NOS，但同組織內(nèi)的同種NOS，在不同的狀態(tài)下可能其功能是不同的。近來發(fā)現(xiàn)iNOS并非一定在誘生下才表達(dá)活性；大鼠腎小球在靜息狀態(tài)下存在類似于小鼠巨噬細(xì)胞的iNOS，而腎內(nèi)弓形和小葉間動(dòng)脈則為類似于大鼠血管平滑肌的iNOS，因此腎內(nèi)iNOS也可調(diào)節(jié)基礎(chǔ)狀態(tài)下的細(xì)胞功能。相反，ecNOS也受運(yùn)動(dòng)、缺氧、機(jī)械刺激等因素調(diào)節(jié)；故iNOS和cNOS誘導(dǎo)或自主合成NO是相對(duì)的，可能僅僅是刺激因素種類及強(qiáng)度不同而已。 NO的合成及調(diào)節(jié) 左旋精氨酸（L-Arg）和分子氧作為底物在其限速酶NOS的作用下，生成中間產(chǎn)物對(duì)羥基-左旋精氨酸，繼續(xù)氧化后生成NO，NO激活鳥氨酸環(huán)化酶使cGM

4、P水平增高而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，這一途徑稱為L(zhǎng)-Arg-NO通道，簡(jiǎn)稱NO通道。合成后的NO半衰期為3-6秒。NOS是NO合成的限速酶，是調(diào)節(jié)NO的最重要環(huán)節(jié)。包括NO合成底物、產(chǎn)物的調(diào)節(jié)，但其作用較弱。cNOS主要由鈣離子調(diào)節(jié)其活性，而iNOS主要由毒素，細(xì)胞因子等介導(dǎo)，通過對(duì)表達(dá)、轉(zhuǎn)錄、翻譯各環(huán)節(jié)對(duì)其調(diào)節(jié)進(jìn)而調(diào)節(jié)NO的合成量。近來發(fā)現(xiàn)iNOS的調(diào)節(jié)在不同種屬間差異很大，如IL-1，TNF不能引導(dǎo)牛巨噬細(xì)胞iNOS的表達(dá)，但對(duì)小鼠則有顯著的誘導(dǎo)活性3。因此，NOS，NO的調(diào)節(jié)是一個(gè)非常復(fù)雜的過程。 NO的生理效應(yīng) 血管擴(kuò)張作用NO使cGMP升高，再經(jīng)cGMP激活相關(guān)蛋白激酶，使血管平滑肌松弛，

5、血管擴(kuò)張。 抑制血小板聚集與粘附NO使血小板中cGMP含量升高，導(dǎo)致胞漿游離鈣進(jìn)入亞細(xì)胞器而使其濃度降低，從而抑制其聚集粘附4。 細(xì)胞保護(hù)作用 低濃度的NO對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是：經(jīng)擴(kuò)張血管而改善細(xì)胞灌注及抑制血小板功能，產(chǎn)生抗凝效應(yīng)。NO與谷氨酸的巰基結(jié)合，經(jīng)亞硝?；纬啥蜴I而使谷氨酸受體調(diào)控離子通道下調(diào)，防止細(xì)胞內(nèi)鈣超載，另一方面也防止NO 向NO-轉(zhuǎn)變，從而阻止NO-與超氧陰離子反應(yīng)而產(chǎn)生的細(xì)胞毒性物質(zhì)。 信號(hào)傳遞作用NO是小分子脂溶性化合物，易通過細(xì)胞膜自由彌散，化學(xué)性質(zhì)活潑，體內(nèi)廣泛存在著以其為遞質(zhì)的神經(jīng)系統(tǒng)，在信號(hào)傳遞中起著重要作用5。 炎癥介質(zhì)作用在血管內(nèi)皮細(xì)胞、平

6、滑肌細(xì)胞及粒細(xì)胞中均有NOS存在，在炎癥時(shí)它可使血管通透性增加，炎細(xì)胞、蛋白滲出加劇。 細(xì)胞毒性作用在高濃度狀態(tài)下（nmol水平），NO對(duì)細(xì)胞有損傷作用，與超氧陰離子反應(yīng)生成超氧亞硝酸根離子，后者及其分解產(chǎn)物羥自由基可導(dǎo)致細(xì)胞毒性作用。同時(shí)還可引起細(xì)胞核酸亞硝酰化，破壞DNA結(jié)構(gòu)，形成亞硝酰鐵絡(luò)合物，從而抑制某些細(xì)胞呼吸和DNA復(fù)制有關(guān)的酶活性6。 NO、NOS與缺血再灌注損傷 近年來關(guān)于NO及NOS對(duì)缺血再灌注損傷的研究頗多，但結(jié)論不一，現(xiàn)將其主要觀點(diǎn)介紹如下。 NO、NOS對(duì)缺血再灌注損傷有保護(hù)作用 Osei等7用鐮狀細(xì)胞性貧血的轉(zhuǎn)基因鼠及正常鼠觀察其在缺氧時(shí)的變化，基因鼠cNOS表達(dá)缺失

7、，在缺血區(qū)及其iNOS表達(dá)是升高的，正常鼠iNOS表達(dá)則不升高且分布無序；組織學(xué)檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)基因鼠缺血區(qū)組織結(jié)構(gòu)的損傷較正常對(duì)照鼠明顯減輕，提示iNOS對(duì)缺血缺氧性損傷有保護(hù)作用。另一組研究顯示兔心肌缺血再灌注時(shí)加用消心痛或NO的底物L(fēng)-Arg，可減輕缺血灌注時(shí)的心律失常及左室末期壓和冠狀動(dòng)脈阻力升高，但加用NOS的抑制劑NG-monocethyl-L-arginine(L-NMMA)則使上述改變加劇。Yang等8對(duì)心肌缺血再灌注鼠用脂多糖誘導(dǎo)其NO升高，結(jié)果使冠狀動(dòng)脈阻力和心律失常發(fā)生率均降低，缺血心肌細(xì)胞得以保護(hù)，也證實(shí)了這一點(diǎn)。NO可抑制細(xì)胞膜鈣通道活性，減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載，研究顯示NO可抑

8、制5-HT介導(dǎo)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞Ca i升高，調(diào)節(jié)細(xì)胞器儲(chǔ)存鈣的釋放，從而使血管舒張9。Kannam等10用NO供體S-nitroso-N-acetyl-d,L-penicillamine(SNAP）使NO合成增加可抑制氣管平滑肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)鈣的釋放，從而使Ca i降低。NO可通過cGMP途徑消除氧自由基。Yasmin等11用缺血再灌注鼠心于缺血前5分鐘和再灌注開始5分鐘用NO供體SMAP灌注，可使超氧亞硝酸根離子和超氧陰離子明顯減少，心功能得以保護(hù)。NO可抑制細(xì)胞間粘附分子-1（ICAM-1）的表達(dá)，從而使中性粒細(xì)胞的粘附及滲入減輕，組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能得以保護(hù)。 NO、NOS加重心肌缺血再灌注

9、損傷 有研究顯示組織缺血再灌注NO、NOS是增高的，且這種增高與缺血再灌注損傷的程度呈正比。Barnard等12發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放陰離子，這些氧自由基的產(chǎn)生對(duì)組織細(xì)胞有明顯的致?lián)p作用。研究還發(fā)現(xiàn)NO可使TNF升高而導(dǎo)致細(xì)胞損傷。一組用低劑量NO吸入3周以觀察其對(duì)鼠肺動(dòng)脈高壓作用的研究結(jié)果顯示其并不能擴(kuò)張血管而使肺動(dòng)脈壓降低，也不能預(yù)防血管平滑肌增厚13。Izomi等14用NOS抑制劑7-nitrondazole（7-NI）對(duì)海馬區(qū)缺血鼠進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果使缺血性損傷得以改善。用ncNOS表達(dá)缺失的鼠制造的腦缺血再灌注模型顯示其梗塞范圍及腦水腫程度均較對(duì)照組明顯減輕15。用NG-nitro-L-a

10、rginine methl ester(L-NAME)抑制NO合成可使心肌氧耗量明顯降低16；而用脂多糖誘導(dǎo)鼠心肌細(xì)胞iNOS的表達(dá)，使NO合成增加，結(jié)果引起心肌的收縮功能降低17。這些均支持NOS、NO參與了缺血再灌注損傷。先前研究認(rèn)為cNOS對(duì)缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，僅iNOS缺血再灌注時(shí)激活而產(chǎn)生過量的NO才對(duì)組織細(xì)胞有害，然而近來大量研究顯示cnNOS對(duì)缺血再灌注損傷有加劇作用18。一組超氧化物岐化酶（SOD）轉(zhuǎn)基因鼠腦缺血再灌注研究顯示，當(dāng)加用cNOS非選擇性抑制L-LAMW一起抑制ecNOS及ncNOS時(shí)，梗塞范圍擴(kuò)大，而用選擇性ncNOS抑制劑7-NI時(shí)，則梗塞范圍縮小，提示e

11、cNOS對(duì)缺血再灌注損傷有保護(hù)作用而ncNOS則有害，且SOD對(duì)組織細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制還包括其對(duì)ncNOS的抑制及對(duì)ecNOS的促進(jìn)18。    對(duì)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的巨大的差異目前尚無確切的解釋，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬的差異，缺血及再灌注組織、程度的不同及時(shí)間長(zhǎng)短的不同必然會(huì)導(dǎo)致其結(jié)論的差異。檢測(cè)的時(shí)相不同甚至可得出截然相反的結(jié)論。在對(duì)大鼠心肌缺血20min后再灌注的研究中發(fā)現(xiàn)，再灌注開始30s時(shí)，心肌的NO、超氮亞硝酸根離子和超氧陰離子是增高的，用NOS抑制劑L-NMMA或SOD均可使這種改變減輕；但于再灌注30min時(shí)，卻是減少的，組織產(chǎn)生的氧自由基產(chǎn)物可被增加灌注的

12、供體SNAP所抑制并伴隨心功能的改善。有研究顯示大鼠心肌缺血再灌注NOS損傷時(shí)于缺血早期心肌的灌注是增加的，且于再灌注1h即達(dá)峰值，隨后降低，至再灌注12h達(dá)低谷又有所回升，當(dāng)于缺血早期使用N-乙酰半胱氨酸，即可減輕缺血再灌注NOS的增高，又可減輕后期NOS的降低，并伴隨心肌梗死范圍的縮小，提示NO、NOS于再灌注不同時(shí)期的病理生理效應(yīng)是不同的11。另一組大量腎缺血再灌注傷的研究顯示，當(dāng)用不含中性粒細(xì)胞（PMN）的灌注液灌注時(shí)，NO使腎小球?yàn)V過率和腎小管的鈉重吸收率降低，用NOS抑制劑NG-nitro-L-arginine(L-NNA)可改善這些變化，但當(dāng)用含PMN的灌注液灌注時(shí)，NO則使PM

13、N在缺血組織中的滯留減少并改善腎小球?yàn)V過率及腎小管對(duì)鈉的重吸收功能，這時(shí)如加用L-NNA反而加劇腎的缺血再灌注損傷19。因此，有必要對(duì)多種屬的動(dòng)物進(jìn)行不同狀態(tài)下的多時(shí)相點(diǎn)的動(dòng)態(tài)觀察，并對(duì)NO、NOS進(jìn)行嚴(yán)格的定量分析并進(jìn)行干預(yù)，觀察調(diào)整其表達(dá)缺血再灌注損傷的影響及其機(jī)制，以期達(dá)到預(yù)防缺血再灌注損傷的目的。 綜上所述，NO、NOS與缺血再灌注損傷有密切的關(guān)系，但其確切的作用機(jī)制仍不清楚，可能在不同的動(dòng)物、組織，在不同的缺血再灌注時(shí)其含量、活性及病理生理效應(yīng)是不同的，在缺血再灌注的不同時(shí)期用不同的方法調(diào)整NOS、NO的表達(dá)量，使其維持在一個(gè)適當(dāng)?shù)姆秶?，可望成為一種新的抗缺血再灌注損傷療法，故有必要

14、對(duì)其作進(jìn)一步的深入研究。    參考文獻(xiàn) Marletta MA,J Biol Chem,1993;268(17)12231-12234 Vodovotz Y,Rusell D,Xie QW et al.J Immunol,1995;154(6):2914-2925 Adler H,Frech B,Thony M et al.J Immunol,1995;154(9):4710-4718 Goldstein IM,Ostnald P,Roth S.Vision Res,1996;36(18):2979-2984 Maiese K,J Neruochem,

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