大鼠組織因子(TF)酶聯(lián)免疫分析

1、大鼠組織因子(TF)酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書本試劑盒僅供研究使用產(chǎn)品編號：CSB-E07914r檢測范圍：6.25 pg/ml - 400 pg/ml最低檢測限：2 pg/ml特異性：本試劑盒可同時檢測天然或重組的大鼠TF，且與其他相關蛋白無交叉反應。有效期：6個月預期應用：ELISA法定量測定大鼠血清、血漿或其它相關生物液體中TF含量。說明 1試劑盒保存：-20（較長時間不用時）；2-8（頻繁使用時）。2濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。 3中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。4剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正常現(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造

2、成任何影響。概述TF是一個分子量為47 kD，由263個氨基酸殘基組成的單鏈跨膜糖蛋白，其基因定位于染色體1p211p22，由6個外顯子和5個內(nèi)含子組成。TF按細胞表面抗原命名為CD142，屬類細胞因子超家族成員，具有信號轉(zhuǎn)導功能。TF由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿區(qū)三個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成：(1)胞外區(qū)由219個氨基酸殘基所組成，包括2個二硫鍵及4個結(jié)合F/Fa的關鍵氨基酸殘基，后者是啟動外源性凝血級聯(lián)反應的關鍵部位。(2)跨膜區(qū)是一個由23個氨基酸殘基組成的疏水結(jié)構(gòu)，與磷脂緊密結(jié)合，功能尚未明確。(3)胞內(nèi)區(qū)由21個氨基酸殘基組成，其中存在3個與TF功能活性關系密切的絲氨酸殘基，能被活化的蛋白激酶C(PKC

3、)磷酸化而激活。TF又稱因子，是絲氨酸蛋白酶凝血因子F/Fa的膜受體，與F結(jié)合促使其轉(zhuǎn)化為Fa，并形成TF/a復合體。TF/Fa復合體進一步將無活性的F水解為有活性的Fa，F(xiàn)a與Fa相結(jié)合并在活化血小板磷脂膜表面將凝血酶原酶解為凝血酶而啟動外源性凝血過程。表達TF的單核細胞微粒通過其P選擇素糖蛋白配體(PSGL-1)與血小板P選擇素(P-selectin)相互作用而與活化血小板結(jié)合，在血栓形成過程中起重要作用。TF廣泛表達于各種組織細胞，如內(nèi)皮細胞、單核細胞、巨噬細胞及腫瘤細胞等。正常生理狀態(tài)下TF在細胞表面處于非激活狀態(tài)，血液中血小板及單核細胞不表達TF，活化TF的濃度可能在20 fmol/

4、L以下。在炎癥、腫瘤、缺氧等病理狀態(tài)下，諸多活性物質(zhì)如組胺、腫瘤壞死因子(TNF-)、C-反應蛋白(CRP)等均可誘導血管內(nèi)皮細胞表達TF。研究表明，TF在胰腺癌、乳腺癌、急性白血病及神經(jīng)膠質(zhì)瘤等腫瘤細胞表面及血管內(nèi)皮細胞表達均異常增高，參與腫瘤生物學行為發(fā)生及腫瘤微環(huán)境形成。較之非上皮來源惡性腫瘤，上皮組織來源的癌細胞表達更高的TF。Guan等對34例神經(jīng)膠質(zhì)瘤研究表明，瘤組織TF在蛋白和基因水平表達均明顯增加，并且隨腫瘤分級增高而增加，但在正常腦組織中不表達。實驗原理用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗TF抗體的微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的抗TF抗體、HRP標記的親和素

5、，經(jīng)過徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的TF呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。 試劑盒組成及試劑配制 1. 酶聯(lián)板(Assay plate )：一塊（96孔）。 2. 標準品（Standard）：2瓶(凍干品)。3. 樣品稀釋液(Sample Diluent)：120ml/瓶。4. 生物素標記抗體稀釋液（Biotin-antibody Diluent）：110ml/瓶。5. 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液（HRP-avidin Diluent）：110ml/瓶。6. 生物素

6、標記抗體（Biotin-antibody）：1120l/瓶（1：100）7. 辣根過氧化物酶標記親和素（HRP-avidin）：1120l/瓶（1：100）8. 底物溶液（TMB Substrate）：110ml/瓶。 9. 濃洗滌液（Wash Buffer）：120ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。 10. 終止液（Stop Solution）：110ml/瓶（2N H2SO4）。需要而未提供的試劑和器材1. 標準規(guī)格酶標儀2. 高速離心機3. 電熱恒溫培養(yǎng)箱4. 干凈的試管和Eppendof管5. 系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，最好用多通道移液器6.蒸餾水，容量瓶等標本

7、的采集及保存 1. 血清：全血標本請于室溫放置2小時或4過夜后于1000g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)吮痉庞?20或-80保存，但應避免反復凍融。2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8C 1000 g離心15分鐘，或?qū)吮痉庞?20或-80保存，但應避免反復凍融。注：標本溶血會影響最后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。標本的稀釋原則：首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至標準曲線的范圍內(nèi)，檢測的結(jié)果才是準確的。稀釋的過程中，應做好詳細的記錄。最后計算濃度時，稀釋了“N”倍，標本的濃度應再乘以“N”。標準品的

8、稀釋原則：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為400 pg/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋400 pg/ml，200 pg/ml，100 pg/ml，50 pg/ml，25 pg/ml，12.5 pg/ml，6.25 pg/ml，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 pg/ml，臨用前15分鐘內(nèi)配制。如配制200 pg/ml標準品：取0.5ml（不要少于0.5ml）400 pg/ml的上述標準品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。生物素標記抗體的稀釋原則：臨用前以生物素標記抗體稀釋液稀釋，稀

9、釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100l），實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如10l生物素標記抗體加990l生物素標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則：臨用前以辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100l），實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如10l辣根過氧化物酶標記親和素加990l辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。操作步驟實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭噭┗驑悠废♂寱r，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準

10、曲線。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。1. 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00l，余孔分別加標準品或待測樣品100l，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37反應120分鐘。為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標記抗體工作液 100l（取1l生物素標記抗體加99l生物素標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制），37,60分鐘。3. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分

11、鐘，200l/每孔，甩干。 4. 每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液（同生物素標記抗體工作液） 100l，37，60分鐘。5. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，200l/每孔，甩干。6. 依序每孔加底物溶液90l，37避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔顯色不明顯，即可終止）。7. 依序每孔加終止溶液50l，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液。8. 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液

12、后15分鐘以內(nèi)進行檢測。注：1. 用戶在初次使用試劑盒時，應將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。2. 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是最后加底物溶液及2N H2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。 3. 為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標板加上蓋或覆膜。4. 未使用完的酶標板或者試劑，請于2-8保存。標準品、生物素標記抗體工作液、辣根過氧化物酶標記親和素工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復使用已稀釋過的標準品、生物素標記抗體工作液、或辣根過氧化物酶標記親和素工作液。5. 建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準確性。洗板方法手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復此過程數(shù)次。自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。計算以標準物的濃度為橫坐標（對數(shù)坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。 注意事項1. 當混合蛋白溶液