國內(nèi)外單克隆抗體技術(shù)最新研究進展

1、國內(nèi)外單克隆抗體技術(shù)最新研究進展 國內(nèi)外單克隆抗體技術(shù)最新研究進展 系 別: 生物工程系 學生姓名: 專業(yè)班級: 生物技術(shù)及應用(2)班 學 號:20084310219 指導教師: 年月日 摘要 抗體是機體在抗原刺激下產(chǎn)生的能與該抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白。常規(guī)的抗體制備是通過動物免疫并采集抗血清的方法產(chǎn)生的,因而抗血清通常含有針對其他無關(guān)抗原的抗體和血清中其他蛋白質(zhì)成分。 1975年Kohler和Milstein首先報道,用細胞雜交技術(shù),使經(jīng)綿羊紅細胞SRBC免疫的小鼠脾細胞,與小鼠骨髓瘤細胞融合,創(chuàng)建了第一個B細胞雜交瘤細胞株,獲得了抗SRBC的單克隆抗體。這是免疫學,乃至醫(yī)學史上的一個里

2、程碑。 單克隆抗體技術(shù)是現(xiàn)代生命科學研究的重要工具,在基因和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能研究方面有著不可或缺的作用?？焖僦苽涓哂H合力的單克隆抗體,改進常規(guī)方法制備單抗費時費力且親合力低的弱點,對后基因時代蛋白質(zhì)組學等基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的研究具有巨大的推動作用。同時在生物芯片、臨床醫(yī)學和疾病的診斷與治療以及空間生命科學等應用領(lǐng)域有著廣闊的應用前景。 關(guān)鍵詞:單克隆抗體;研究進展 目 錄摘要?(3)1 概述62 單克隆抗體的誕生、發(fā)展63 單克隆抗體的研究73.1單克隆抗體的概念73.2 單克隆抗體技術(shù)的基本原理74動物免疫94.1抗原制備94.2免疫程序的確定104.3免疫動物的選擇114.4細胞免疫的方法制備

3、單抗134.5多位點重復免疫制備單抗145 單克隆抗體人源化研究進展155.1嵌合抗體165.2 表面重塑165.3 重構(gòu)抗體175.4抗原結(jié)合位點的重構(gòu)175.5 鏈替換185.6 噬菌體表達技術(shù)185.7 轉(zhuǎn)基因動物185.8 人單抗與鼠單抗的比較196 單克隆抗體表達系統(tǒng)的研究206.1 微生物表達系統(tǒng)206.1.1 大腸桿菌表達系統(tǒng)206.1.2 低等真核微生物表達系統(tǒng)216.2 哺乳動物表達系統(tǒng)216.2.1 DNA轉(zhuǎn)移和整合216.2.2 宿主細胞改造226.3 植物細胞表達系統(tǒng)226.4 其他表達系統(tǒng)226.4.1 病毒展示系統(tǒng)226.4.2 酵母展示系統(tǒng)226.4.3 細菌展示

4、系統(tǒng)237 綜述23參考文獻24 1 概述 眾所周知,抗體是由漿細胞分泌的,漿細胞又是由B淋巴細胞轉(zhuǎn)化而來,每個B淋巴細胞株制造它的專有抗體,每株細胞系只能產(chǎn)生一種它專有的、針對一種它能識別的特異性抗原決定簇的抗體。這種從一株單一細胞系產(chǎn)生的抗體就叫單克隆抗體(McAb,簡稱單抗)。但這種細胞不可能在體外長期生長繁殖。為解決這一難題,Kohler和Millstein于l975年首次建立了雜交瘤技術(shù)。 目前,產(chǎn)生各種特異性鼠單抗的雜交瘤細胞株已經(jīng)建立,并有許多細胞株成為良好的生產(chǎn)種細胞。除B淋巴細胞雜交瘤外,具有多種T淋巴細胞功能的T細胞雜交瘤和T-B細胞雜交瘤亦已經(jīng)建立起來。由于單抗的應用是從

5、體外診斷向體內(nèi)腫瘤定位和治療方向發(fā)展,故鼠源性單抗出現(xiàn)了難以克服的缺點,特別是在體內(nèi)應用時,存在主要組織相容性抗原 MHCI1超敏反應問題,因此現(xiàn)在的單抗已向人源化方向發(fā)展。1980年人-人B淋巴細胞雜交瘤融臺成功,1981年又成功融合了具有抑制功能的人T淋巴細胞雜交瘤。這些研究成果為現(xiàn)代生物技術(shù)制藥開辟了廣闊的前累。2 單克隆抗體的誕生、發(fā)展 第一代單抗誕生于1975年,來源于小鼠的B細胞雜交瘤,稱為鼠源性單抗。人的免疫系統(tǒng)可以識別鼠源性單抗,產(chǎn)生人抗鼠抗體(HAMAs),將其清除出體外,因此限制了它的應用。隨后研究人員采用基因工程的方法生產(chǎn)人源或人源化的單抗以及嵌合型的單抗,特別是在198

6、4年報道研究出了人-鼠雜交瘤的構(gòu)建方法,在1987年進行了第一次臨床試驗?；谝环N單抗中人源的部分越多其療效越高的假設(shè),人源化單抗于1986年開始生產(chǎn),并于1988年進行了第一次商業(yè)性的臨床試驗。 根據(jù)用途的不同,單抗大體上可分為三類,即診斷用單抗(如肝炎化驗用單抗等)、治療用單抗、“生物導彈”用單抗。單抗為人類疾病的防治和診斷、腫瘤體內(nèi)定位、靶向藥物的制備、防止移植物的排異反應、新型疫苗的研制提供了較為理想的手段。3 單克隆抗體的研究3.1單克隆抗體的概念 抗體是機體在抗原刺激下產(chǎn)生的能與該抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白。動物脾臟有上百萬種不同的B淋巴細胞系,每一個B淋巴細胞在成熟的過程中通過隨

7、機重排只產(chǎn)生識別一個抗原受體基因,重排后具有不同基因不同的B淋巴細胞合成不同的抗體。當機體受抗原刺激時,抗原分子上的許多決定簇分別即或各個具有不同基因的B細胞。被激活的B細胞分裂增殖形成效應B細胞(漿細胞)和記憶B細胞,大量的漿細胞可得到由單細胞經(jīng)分裂增殖而形成細胞群,即單克隆。單克隆細胞將合成針對一種抗原決定簇的抗體,稱為單克隆抗體(Monoclonalantibody,簡稱McAb)。3.2 單克隆抗體技術(shù)的基本原理 所謂的單克隆抗體是指由單一克隆雜交瘤細胞產(chǎn)生的只識別某一特定抗原表位的同源抗體。 單克隆抗體是經(jīng)過人工制備的一類特殊抗體,它具有一般抗體的性質(zhì);它是B細胞增殖分化為漿細胞所產(chǎn)

8、生的一類球蛋白,存在于體液中,具有免疫功能 ,介導體液免疫;它能與相應抗原如病原體特異性結(jié)合,在其他免疫分子和細胞的參入下發(fā)揮免疫效應 ?單克隆抗體的本質(zhì)是球蛋白,具有球蛋白的理化性質(zhì),空間結(jié)構(gòu)和生物學活性.球蛋白對熱和化學物質(zhì)敏感,加熱和加入化學試劑易破壞其結(jié)構(gòu),具有一定的半衰期.它和球蛋白一樣具有可變區(qū)和恒定區(qū),可變區(qū)結(jié)合抗原,形成抗原抗體復合物;恒定區(qū)有補體結(jié)合位點,介導補體發(fā)揮作用,形成攻膜復合物,殺傷變異的細胞. 要制備單克隆抗體需要先獲得能合成專一性抗體的單克隆B淋巴細胞,但這種B淋巴細胞不能在體外生長。而實驗發(fā)現(xiàn)骨髓瘤細胞可在體外生長繁殖,應用細胞雜交技術(shù)使骨髓瘤細胞與免疫的淋巴

9、細胞二者合二為一,得到雜種的骨髓瘤細胞。這種雜種細胞繼承兩種親代細胞的特性,它既具有B淋巴細胞合成專一性,也有骨髓瘤細胞能在體外培養(yǎng)增殖永存的特性,用這種來源于單個融合細胞培養(yǎng)增殖的細胞群?？芍苽湟环N抗原決定簇的特異單克隆抗體。 常規(guī)的抗體制備是通過動物免疫并采集抗血清的方法產(chǎn)生的,因而抗血清通常含有針對其他無關(guān)抗原的抗體和血清中其他蛋白質(zhì)成。 實驗證明用某些原核表達蛋白免疫動物制備的抗血清只能與變性蛋白反應,而不能結(jié)合天然抗原,這一現(xiàn)象在用桿狀病毒表達的蛋白中也存在。盡管這類抗體能用于Western Blot實驗,但研究天然蛋白的結(jié)構(gòu)與功能則受到很大的限制。而用真核表達系統(tǒng)如酵母、昆蟲和哺乳

10、類動物細胞表達蛋白質(zhì),存在著實驗周期更長、表達產(chǎn)量更低、技術(shù)難度更大等問題。 另一方面,體內(nèi)生產(chǎn)單抗的方法是腹水誘導法。該法簡便、成本低、抗體濃度高、產(chǎn)量大,因而長期取代體外培養(yǎng),為實驗室所普遍采用。在小鼠腹腔,雜交瘤細胞密度近似于實體組織,約1091010個/ cm3,抗體質(zhì)量濃度較高,可達110 g/ L,無支原體污染,只混有少量小鼠蛋白,可以接種不同數(shù)量的小鼠以滿足不同的單抗需要量。此法生產(chǎn)單抗純度高、生產(chǎn)成本低、周期短,不需要昂貴的設(shè)備,因此,長期以來被廣泛采用。但是,腹水誘導法也存在一些不利因素,如混雜有小鼠免疫球蛋白、具有反應活性的細胞因子及病原因子、批與批之間單抗特異性不穩(wěn)定,加

11、上人道主義原因,芬蘭與德國已禁止使用該技術(shù),美國、英國、瑞士、加拿大等國也加強了對該技術(shù)使用的限制。許多研究者開始轉(zhuǎn)向體外單抗生產(chǎn)技術(shù)的開發(fā),并建立了許多用于不同規(guī)模的生產(chǎn)技術(shù)。 現(xiàn)代分子生物學和免疫學技術(shù)使人們可以采取多種手段克服以上不足,其中最有前景的方法就是DNA 免疫、細胞免疫。4動物免疫4.1抗原制備 制備單克隆抗體的免疫抗原,從純度上說雖不要求很高,但高純度的抗原使得到所需單抗的機會增加,同時可以減輕篩選的工作量。因此,免疫免疫抗原是越純越好,應根據(jù)所研究的抗原和實驗室的條件來決定。一般來說,抗原的來源有限,或性質(zhì)不穩(wěn)定,提純時易變性,或其原性很強,或所需單抗是用于抗原不同組分的純

12、化或分析等,免疫用的抗原只需初步提純甚至不提純,但抗原中混雜物很多,特別是如果這些混雜物的免疫原性較強時,則必須對抗原進行純化。檢測用抗原可以是與免疫抗原純度相同,也可是不同的純度,這主要決定于所用篩檢方法的種類及其特異性和敏感性。4.2免疫程序的確定 免疫是單抗制備過程中的重要環(huán)節(jié)之一,其目的在于使B淋巴細胞在特異抗原刺激下分化、增殖,以利于細胞融合形成雜交細胞,并增加獲得分泌特異性抗體的雜交瘤的機會。 DNA 免疫的機理:第一步是成功地轉(zhuǎn)染細胞,被吸收的質(zhì)粒在哺乳動物強啟動子作用下,合成mRNA ,進而合成免疫原性蛋白。第二步則是從該類細胞將目的蛋白轉(zhuǎn)移到抗原提呈細胞antigenpres

13、ent cell APC。目前提出兩種機制:肌細胞分泌蛋白該假設(shè)已經(jīng)得到證實;細胞死亡后APC獲取蛋白如通過凋亡。第三步是APC 呈遞蛋白至類或類主要組織相容性復合物major histo2compatibility complex,MHC途徑。 目前,運用DNA 免疫的方法,已成功制備了生長激素、flt3、凝血因子IX、INF2和血型抗原等,病原微生物如:prion、Helicobacter pylori 和HIV ,膜分子G蛋白偶連受體等的單克隆抗體。最近Li等采用肌肉組織特異性的啟動子來進一步提高DNA 免疫的效果,其基本思想是構(gòu)建含肌肉組織特異啟動子DNA 免疫載體,使抗體的親合力增加

14、了10 倍。因此,在目的基因前加上肌肉組織特異的啟動子或改構(gòu)表達載體上的調(diào)控序列,可提高DNA 免疫抗體的親合力。 DNA 免疫制備單克隆抗體除了快速,簡便,高產(chǎn),高效外。由于基因操作簡單,對免疫原性較弱的蛋白,通過與免疫原性較強的蛋白構(gòu)建融合基因載體進行免疫,如HIV 的外殼基因Env 和補體成分C3d DNA疫苗表達融合蛋白可增強HIV 外殼蛋白抗體的親合力成熟;同時也可以構(gòu)建含有多種蛋白的融合基因載體進行免疫,產(chǎn)生針對不同蛋白的單克隆抗體。因此,DNA 免疫的研究越來越受到關(guān)注,其應用也越來越廣泛。4.3免疫動物的選擇 根據(jù)所用的骨髓瘤細胞可選用小鼠和大鼠作為免疫動物。因為,所有的供雜交

15、瘤技術(shù)用的小鼠骨髓瘤細胞系均來源于BALB/c小鼠,所有的大鼠骨髓瘤細胞都來源于LOU/c大鼠,所以一般的雜交瘤生產(chǎn)都是用這兩種純系動物作為免疫動物。但是,有時為了特殊目的而需進行種間雜交,則可免疫其他動物。種間雜交瘤一般分泌抗體的能力不穩(wěn)定,因為染色體容易丟失。就小鼠而言,初次免疫時以8-12周齡為宜,雌性鼠較便于操作。 在設(shè)計免疫程序時,考慮到抗原的性質(zhì)和純度、抗原量、免疫途徑、免疫次數(shù)與間隔時間、佐劑的應用及動物對該抗原的應答能力等。沒有一個免疫程序能使用于各種抗原。 現(xiàn)用的免疫程序中多數(shù)是參照制備常規(guī)多克隆抗體的方法。表6-1列舉了目前常用的免疫程序。 免疫途徑常用體內(nèi)免疫法包括皮下注

16、射、腹腔或靜脈注射,也采用足墊、皮內(nèi)、滴鼻或點眼。最后一次加強免疫多采用腹腔或靜脈注射,目前尤其推崇后者,因為可使抗原對脾細胞作用更迅速而充分。在最后一次加強免疫后第3天取脾融合為好,許多實驗室的結(jié)果表明,初次免疫和再次免疫應答反應中,取脾細胞與骨髓瘤細胞融合,特異性雜交瘤的形成高峰分別為第4天和第22天,在初次免疫應答時獲得的雜交瘤主要分泌IgM抗體,再次免疫應答時獲得的雜交瘤主要分泌IgG抗體。筆者體會陽性雜交瘤出現(xiàn)的高峰與小鼠血清抗體的滴度并無明顯的平行關(guān)系,且多在血清抗體高峰之前。 因此,為達到最高的雜交瘤形成率需要有盡可能多的漿母細胞,這在最后一次加強免疫后第3天取脾進行融合較適宜。

17、已有人報道采用脾內(nèi)免疫,可提高小鼠對抗原的免疫反應性,且節(jié)省時間,一般免疫3天后即可融合。 體內(nèi)免疫法使用于免疫原性強、來源充分的抗原,對于免疫原性很弱或?qū)C體有害(如引起免疫抑制)的抗原就不適用了。如果制備人單克隆抗體幾乎不大可能采用體內(nèi)免疫法。 因此,針對這些情況,可采用體外免疫。所謂體外免疫就是將脾細胞(或淋巴結(jié)細胞,或外周淋巴細胞)取出體外,在一定條件下與抗原共同培養(yǎng),然后再與骨髓瘤細胞進行融合。其基本方法是取4-8周齡BALB/c小鼠的脾臟,制成單細胞懸液,用無血清培養(yǎng)液洗滌2-3次,然后懸浮于含10%小牛血清的培養(yǎng)液中,再加入適量抗原(可溶性抗原0.5-5ug/ml,細胞抗原105

18、ml)和一定量的BALB/c小鼠胸腺細胞培養(yǎng)上清液;在37,6%CO2濃度下培養(yǎng)3-5天,再分離脾細胞與骨髓瘤細胞融合。表6-1 不同免疫抗原的免疫程序免疫原特性抗原量接種次數(shù)間隔時間單抗的特性抗體滴度親和性免疫原性強(如細胞、細菌和病毒等)106-107個細胞或1-10ug2-42-4周高中等至強免疫原性中等10-100ug2-42-4周中等或高中等或強免疫原性弱A.20-400ug2-4隨后2-3每月2-3月中等強B.10-50ug其后200-400ug2其后4每月每天中等中等C.10-100ug2其后4其后“休息”最后加強每月10天1-2月中等中等或強4.4細胞免疫的方法制備單抗 基本原

19、理就是利用糖基磷脂酰肌醇(GPI )錨蛋白能錨定在細胞膜表面的特點,用目的基因替代天然GPI 錨定蛋白基因的3末端,構(gòu)建真核表達載體后轉(zhuǎn)染細胞,目的蛋白能表達在細胞膜表面,該細胞免疫小鼠后會產(chǎn)生針對外源基因蛋白的特異性抗體,然后用流式細胞儀篩選細胞膜表面高表達外源蛋白的細胞,用于篩選產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細胞株。 但由于細胞膜表面有大量的膜表面分子,機體會同時產(chǎn)生針對這些分子的抗體,所以GPI 的方法的應用有一定的局限性。利用消減免疫 subt ractive immu2nization ,SI 改良該方法,即先用未轉(zhuǎn)染的細胞免疫小鼠一段時間后,然后給小鼠注射免疫抑制劑環(huán)磷酰胺cyclopho

20、sphamide,這樣就可以抑制機體產(chǎn)生針對細胞膜表面分子的抗體,然后用轉(zhuǎn)染細胞進行免疫,這樣,小鼠體內(nèi)主要產(chǎn)生針對目的基因蛋白的抗體。SI 在用細胞和蛋白免疫制備單克隆抗體的過程中,取得了理想的結(jié)果。4.5多位點重復免疫制備單抗 Kilpat rick 和Bynum等報道了另一種免疫技術(shù)。他們在蛋白免疫、DNA 免疫和細胞免疫的基礎(chǔ)上,結(jié)合多位點重復免疫 repetitive immunizations multiple sites,RIMMS 技術(shù),大大縮短了制備單克隆抗體的時間,將抗原或DNA 免疫713 d 的小鼠引流淋巴結(jié)細胞與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Bcl22基因的瘤細胞融合,成功地制備了針對免疫

21、原高親合力的單克隆抗體。 RIMMS 技術(shù)原理: RIMMS技術(shù)原理:T細胞依賴的B細胞反應的成熟與次級淋巴組織中發(fā)育的動態(tài)微環(huán)境?生發(fā)中心(GC)的形成有關(guān)。樹突狀細胞(DC)從抗原遞呈位點攝取和傳遞抗原,在區(qū)域淋巴結(jié)內(nèi)立即引起T細胞依賴的B細胞反應。免疫后3-5d,抗原致敏的T細胞、B細胞與APC識別性相互作用,導致GC的形成。GC中由于B細胞擴增并經(jīng)歷抗原驅(qū)使的成熟和選擇過程,抗原特異性的免疫球蛋白的所有組分得以發(fā)育。GC的形成、擴增和縮小大約在免疫后16d內(nèi)完成,誘發(fā)抗原特異性的末端漿細胞和記憶細胞的產(chǎn)生。GC的暗區(qū)(DZ)內(nèi)中央胚細胞的體細胞超突變期間V區(qū)免疫球蛋白基因內(nèi)發(fā)生點突變,

22、導致抗原免疫后710d形成親和力成熟的免疫球蛋白?？乖禺愋灾醒爰毎倪x擇發(fā)生在GC的明區(qū)(LZ),這一過程與濾泡樹突狀細胞(FDC)和T輔助細胞的識別和非識別信號傳導有關(guān)。表現(xiàn)抗原特異性、親和力成熟sig的中央細胞進一步分化成熟的記憶細胞或末端漿細胞,而那些未被選擇的B細胞重新進入DZ并經(jīng)歷進一步的體細胞突變和選擇過程。 同常規(guī)方法制備單克隆抗體相比,RIMMS 有很多優(yōu)點: 采用RIMMS 方法制備高親合力的mAbs 僅需要12 只小鼠和少量的抗原400 ng3g/ 位點 或DNA 2.5100g/ 位點 ; RIMMS還免除了免疫過程中試血過程。迄今為止,已經(jīng)建立了快速制備包括合成肽、重

23、組蛋白、細胞提取物、連接復合物以及體內(nèi)DNA 免疫后表達蛋白等多種免疫原mAbs 的方法,并廣泛用于EL ISA、免疫沉淀、競爭性聯(lián)結(jié)、免疫印漬分析、免疫細胞化學或免疫組化等方面的研究。將消減免疫、RIMMS 的方法與DNA免疫和細胞免疫的方法相結(jié)合,建立一種快速制備高親合力抗體的實驗方法,將大大縮短單抗制備的周期,對蛋白組學和蛋白質(zhì)芯片的研究有巨大的推動作用。5 單克隆抗體人源化研究進展 最早的單克隆抗體是從小鼠獲得的,為人體抗小鼠抗體(HAMA),隨著抗體工程技術(shù)的發(fā)展。一些嵌入式或擬人化的單克隆抗體產(chǎn)品已獲得批準,有可能是所有的單克隆抗體人源化,并可降低免疫排斥反應的危險性。 雖然鼠源單

24、抗能特異識別抗原,但在人體中常不能有效激活補體和Fc受體相關(guān)的效應系統(tǒng);再次,外源抗體在人體循環(huán)系統(tǒng)中很快被清除。因此,根據(jù)抗體結(jié)構(gòu)與功能之間的聯(lián)系,在保持原單抗對特異抗原表位的高親和力的基礎(chǔ)上對其進行體外人源化改造,減少異源抗體的免疫原性成為改進單抗治療的重點。目前報道的人源化方法主要有:嵌合、表面重塑 resurfacing、重構(gòu) reshaping 以及鏈替換chain shuffling。5.1嵌合抗體 Mo rrison 等從雜交瘤細胞中獲得抗體V 區(qū)cDNA ,克隆到重組了人抗體C 區(qū)的載體中,轉(zhuǎn)化哺乳動物細胞表達出人鼠嵌合抗體。改造后的抗體保留了原單抗特異結(jié)合抗原的V 區(qū),去除了

25、非人源序列C 區(qū) ; 但由于其整個V 區(qū)都是異源的,所以嵌合抗體的異源性還很明顯,解決HAMA 的效果并不理想。嵌合抗體完整地保留了異源單抗的V 區(qū),最大限度地保持了其親和活性,可作進一步改造的親和力參照體,也是進一步提高補體活化及細胞毒作用等的基礎(chǔ)對照。5.2 表面重塑 通常認為,抗原上的抗原決定簇應具殘基的運動性和溶劑的可及性,多集中在抗原表面,因此可推測異源抗體在人體內(nèi)引起免疫反應的主要抗原決定簇應是該抗體的表面上溶液可及的殘基。5.3 重構(gòu)抗體 重構(gòu)抗體是由異源抗體中與抗原結(jié)合相關(guān)的殘基與人抗體重新拼接構(gòu)建的。表面重塑是對鼠抗體表面氨基酸殘基surface amino acid res

26、idues,SAR 進行人源化改造。該方法的原則是僅替換與人抗體SAR 差別明顯的區(qū)域,在維持抗體活性并兼顧減少異源性基礎(chǔ)上選用與人抗體表面殘基相似的氨基酸替換;另外,所替換的區(qū)段不應過多,對于影響側(cè)鏈大小、電荷、疏水性,或可能形成氫鍵從而影響到抗體互補決定區(qū)complementary determinant region,CDR 構(gòu)象的殘基盡量不替換。但也有相反的理論認為,內(nèi)部的殘基會因為抗原在遞呈過程中的加工暴露出來,表現(xiàn)出免疫原性。雖然如此至今還沒有表面重塑的人源化抗體在體內(nèi)實驗中引起HAMA的報道。5.4抗原結(jié)合位點的重構(gòu) CDR 移植該方法是人源化單抗最常用、最基本的方法,很多CDR

27、 移植抗體在臨床實驗中取得了較好效果。SDR 轉(zhuǎn)移用X 射線晶體衍射檢測不同物種抗體與抗原結(jié)合的特征后,發(fā)現(xiàn)并不是整個CDR 都參與與抗原的特異性識別、結(jié)合,而是由一些特定的區(qū)域特定決定區(qū),SDR 執(zhí)行該功能,據(jù)此提出了SDR 轉(zhuǎn)移法:將異源抗體中與抗原結(jié)合密切相關(guān)的SDR 等少數(shù)殘基移植到人抗體相應位置上。5.5 鏈替換 實驗發(fā)現(xiàn)一些抗體中輕、重鏈V 區(qū)在結(jié)合抗原中起的作用不同,對于作用較弱的鏈進行鏈替換,同樣可以獲得高親和力的抗體。應用重鏈鏈替換Park 等成功地人源化抗乙型肝炎病毒HBV 前S1 的單抗,所得抗體保持了抗體活性,同時免疫原性明顯降低。5.6 噬菌體表達技術(shù) 這是利用噬菌體

28、表面表達人體功能性抗體片段技術(shù)。目前數(shù)據(jù)庫已經(jīng)擁有1000億個從體外得到的各種抗體,可以迅速地篩選出各種抗原,具有較高親和力的抗體。這些抗體可以用遺傳工程的方法開發(fā)出人源化抗體產(chǎn)品。 英國劍橋抗體技術(shù)公司是這方面的先驅(qū)。噬菌體表達方法除了能得到完全人源化的答克隆抗體外,主要特點是加快了抗體篩選的速度,用傳統(tǒng)免疫方法得到的小鼠答克隆抗體耗時8周到半年,現(xiàn)在不到1星期。5.7 轉(zhuǎn)基因動物 轉(zhuǎn)基因動物的發(fā)展也很快,已經(jīng)從轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)展到了轉(zhuǎn)基因羊和轉(zhuǎn)基因牛等。單克隆抗體領(lǐng)域的應用是用動物得到完全人源化的單克隆抗體。由于轉(zhuǎn)基因小鼠已經(jīng)有了人類抗體基因,所以在用異體抗原免疫時,可以得到人類抗體。美國已經(jīng)

29、有了兩家公司得到了小鼠的轉(zhuǎn)基因株,他們分別是Abgenix和Medarex公司。 現(xiàn)在抗體研究已經(jīng)進入了收獲階段,已經(jīng)有了9個人源化單克隆抗體產(chǎn)品。致力于人源化單克隆抗體開發(fā)的企業(yè)已有250家,正在開發(fā)中的產(chǎn)品有700多個,其中100多個已經(jīng)進入臨床研究,單克隆抗體藥物約占所有在開發(fā)的生物技術(shù)藥品的25%左右。5.8 人單抗與鼠單抗的比較 人單抗與鼠單抗相比,具有以下有點: 1人單抗特異性鞍強: 2MHC單抗,可以對人類MHC的結(jié)構(gòu)和功能進行分析;3因是同塬性免疫球蛋白,故應用于人體,不易發(fā)生過敏反應及免疫復合性疾病; 4在人體內(nèi)維持時間較長; 5可制備用于人的抗獨特型抗體。 上述特點使得人單

30、抗為人類疾病防治和論斷、腫瘤體內(nèi)定位.靶向藥物制備、防止移植物排斥反應、新型疫苗研制,提供了較為理想的手段。最近,嗜菌體表達技術(shù)和轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)等的發(fā)展,有可能使所有的單抗人源化,降低免疫排斥反應的危險性。 由于人源單抗的制備具有建株的困難、Ig產(chǎn)量低、穩(wěn)定性和親和力差等難點,且一直缺乏有效的解決辦法。近年來基因工程技術(shù)的發(fā)展,為鼠一人嵌合單抗的制備開創(chuàng)了新的途徑。利用淋巴細胞雜交瘤技術(shù)建立分體特異性單抗雜交瘤細胞系,從中提取已重排的編碼功能性IgDNA基因組組建DNA文庫或成熟的Ig H/L鏈mRNA片段組建cDNA文庫及制備探針,從而獲得編碼特異性單抗的V區(qū)基因;利用DNA重組技術(shù),將此來

31、源于小鼠特異性Ig H.L鏈的C區(qū)基因組重組,構(gòu)建鼠一人嵌臺的Ig重組基因:然后將此重組嵌魯?shù)腎g基因?qū)苏婧吮磉_質(zhì)粒多為pSVz-ypt和pSVz-neo;經(jīng)磷酸鈣沉淀技術(shù)、原生質(zhì)體融舍技術(shù)或電穿孔導人技術(shù),將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動物非分泌型骨髓瘤細胞,經(jīng)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng),從中篩選分泌完整功能性鼠一人嵌臺單抗。6 單克隆抗體表達系統(tǒng)的研究6.1 微生物表達系統(tǒng)6.1.1 大腸桿菌表達系統(tǒng) 對大腸桿菌表達系統(tǒng)的優(yōu)化主要集中在以下幾個方面:a通過突變將稀有密碼子替換為大腸桿菌的常用密碼子,相當于提高轉(zhuǎn)運RNA的相對濃度,進而提高翻譯效率;b通過CDR嫁接將不溶性scFv片段的接觸殘基嫁接到表達好且穩(wěn)定

32、的scFv片斷支架上,提高可溶性產(chǎn)物的表達和重組分子的熱穩(wěn)定性;C與抗體片斷同時表達分子伴侶和折疊酶,有研究表明大腸桿菌中分子伴侶過量表達可提高可溶性功能蛋白質(zhì)的產(chǎn)量;d使抗體片斷和其他蛋白質(zhì)形成融合蛋白以方便純化及減少不溶性重組抗體包涵體的形成。此外,還可利用弱啟動子和降低環(huán)境溫度以降低產(chǎn)物的合成速率,減少包涵體形成。6.1.2 低等真核微生物表達系統(tǒng) 作為另一種微生物表達系統(tǒng),利用酵母和絲狀真菌生產(chǎn)重組抗體或抗體片斷同樣有生產(chǎn)周期短的優(yōu)勢,且這些細胞可在廉價的培養(yǎng)基上培養(yǎng)到100g/L的高密度,相比哺乳動物細胞系統(tǒng)有更大的生產(chǎn)力,被用于生產(chǎn)由于錯誤折疊或要求糖基化而不能利用大腸桿菌合成的抗

33、體或其他蛋白產(chǎn)物。6.2 哺乳動物表達系統(tǒng) 盡管原核表達系統(tǒng)正在朝著有利于人類的方向被優(yōu)化,哺乳動物表達系統(tǒng)在重組抗體或抗體片段的生產(chǎn)方面仍然占據(jù)主導地位。哺乳動物細胞系統(tǒng)有一套較成熟的生產(chǎn)路線:首先重組基因被轉(zhuǎn)人細胞,其次第二個基因也被轉(zhuǎn)入細胞,該基因的作用是使受體細胞獲得選擇優(yōu)勢,在某種選擇試劑存在下,只有表達了該選擇基因的細胞能夠存活。最常用的選擇基因編碼二氫葉酸還原酶DHFR一參與核苷酸代謝,和谷胺酰胺合成酶GS目前該系統(tǒng)提高產(chǎn)量的優(yōu)化措施主要是改進載體、宿主細胞改造、優(yōu)化培養(yǎng)基及篩選方法和過程改造等。6.2.1 DNA轉(zhuǎn)移和整合 目前,依賴于非病毒的基因轉(zhuǎn)移仍是產(chǎn)生穩(wěn)定細胞系的主要方

34、法,如磷酸鈣轉(zhuǎn)染法、電穿孔、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、基因槍法和多聚物介導的基因轉(zhuǎn)移,但具體哪一種方法更有優(yōu)勢不得而知,因為尚缺乏綜合研究。6.2.2 宿主細胞改造 該方向主要著眼于提高蛋白質(zhì)翻譯后修飾和加工系統(tǒng)。此外,細胞系的改造還包括提高對影響存活率的因素的抵抗力及攜帶生長促進基因。3細胞選擇。選擇試劑selection agent最關(guān)鍵的考慮因素是選擇力或嚴謹度,高嚴謹度的試劑可以更有效的選擇表達重組基因及選擇基因的細胞。6.3 植物細胞表達系統(tǒng) 植物細胞表達系統(tǒng)提高產(chǎn)量的措施包括改善表達載體的基因調(diào)控元件,如啟動子和多聚腺苷酸位點,移除不理想的序列或?qū)⑾∮忻艽a子替換為常用密碼子,優(yōu)化產(chǎn)物亞細胞結(jié)構(gòu)

35、的定位,及解決植物和人糖基化系統(tǒng)差異問題等等。6.4 其他表達系統(tǒng)6.4.1 病毒展示系統(tǒng) 通過改造病毒基因組或噬質(zhì)粒將重組抗體基因和病毒外被蛋白基因融合,這些外殼蛋白基因負責噬菌體的侵染和組裝,因此與之連接的重組抗體會同時被展示在病毒表面,進而再通過親和富集法篩選表達有特異性蛋白質(zhì)的病毒,最終獲得具有特異結(jié)合性質(zhì)的產(chǎn)物。6.4.2 酵母展示系統(tǒng) 該技術(shù)同樣通過將目的蛋白基因與酵母基因融合使蛋白質(zhì)在細胞表面展示,與噬菌體系統(tǒng)不同的是,酵母由于體積大,因此可以用流式細胞儀篩選,這方便了具有不同特異親和力抗體的分離。6.4.3 細菌展示系統(tǒng) 該技術(shù)基本原理仍與其它展示技術(shù)類似,一種方法是依賴于革蘭

36、式陰性細菌分泌的自運輸體autotransporter,該蛋白C端有一結(jié)構(gòu)域可插入細菌的外膜并組裝成2rim的親水通道,蛋白質(zhì)的N端可通過此寡聚物通道運輸?shù)郊毎?若將該N端結(jié)構(gòu)域替換為不同的scFv片段或VHH結(jié)構(gòu)域,穩(wěn)定的scFv和VHH片段可以接近100%的效率被展示在細菌細胞表面。此外,還有若干無細胞表達系統(tǒng)被報道,如RNA一肽融合展示系統(tǒng),核糖體展示系統(tǒng)等7 綜述 近年來單克隆抗體生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展使抗體表達平臺擴展到基于微生物、真菌、植物和哺乳動物細胞等表達系統(tǒng)方向,值得一提的是抗體工程通過根據(jù)需要改造宿主細胞極有效的提高產(chǎn)量、延長抗體壽命、優(yōu)化表達后修飾,如對大腸桿菌、真菌、植物細胞

37、糖基化途徑的改造一定程度上可緩解這些生物與人糖基化途徑不同的問題,又如對哺乳動物細胞代謝途徑的改造一方面可提高蛋白產(chǎn)量,一方面改善抗體親和力等性能。目前,如何同時最優(yōu)化抗體產(chǎn)量、特性并選擇最合適的表達系統(tǒng)仍是該領(lǐng)域的熱點和困難,相信不久的將來,隨著重組DNA等分子生物學技術(shù)的進一步發(fā)展,這些困難可以得到解決。 參考文獻1 周珍輝 主編動物細胞培養(yǎng)技術(shù) 中國環(huán)境出版社 2006年8月第一版第一次印刷。188-2412 Mann MJ ,Gibbons GH ,Hutchinson H ,et al 。Pressure2medi2ated oligonucleotide transfection

38、of rat and human cardiovascu2lar tissuesJ 。Proc Natl Acad Sci USA ,1999 ,96 11 :64112-6416.3 Rizzuto G,Cappelletti M ,Maione D,et al 。Efficient and reg2ulated erythropoietin production by naked DNA injection andmuscle electroporationJ 。Proc Natl Acad Sci USA ,1999 ,96 11 :641726422.4 Ulmer JB ,DeWit

39、t CM ,Chastain M ,et al 。Enhancement of DNA vaccine potency using conventional aluminum adjuvants J 。Vaccine 1999 ,18 1 - 2 :1828.5 Singh M ,Briones M ,Ott G,et al 。Cationic microparticles : apotent delivery system for DNA vaccinesJ 。Proc Natl Acad Sci USA ,2000 ,97 2 :8112816.6 Briones M ,Singh M ,Ugozzoli M ,et al 。The preparation ,characterization ,and valuation of cationic microparticles for DNA vaccine delivery J 。Pharmaceutical Research ,2001 ,18 5 :7092722.7 林清華 主編 免疫學實驗 武漢大學出版社 2004年1月