實驗十一應用細胞融合技術制備染色體提前凝集標本

1、實驗十一應用細胞融合技術制備染色體提前凝集標本實驗目的1. 熟悉一般細胞融合技術。2. 染色體提前凝集標本的制備原理、方法及間期細胞三種時相提前凝集染色體的特點。實驗原理細胞融合是指在自然條件下或用人工方法（生物、物理或化學方法）使兩個或兩個以上的細胞合并形成一個細胞過程。細胞融合目前已被廣泛應用于生物學和醫(yī)學研究的各個領域。細胞融合的誘導物種類很多，常用的主要有滅活的仙臺病毒，聚乙二醇（peg）和電脈沖。目前最廣泛應用的是聚乙二醇。peg的促融機制尚不清楚，它可能引起細胞中磷脂的酰鍵及極性集團兩者在結構上發(fā)生重排。在間期細胞中，遺傳物質（dna）是以染色質形式存在的，看不到分裂期（m期）才出

2、現(xiàn)的染色體。七十年代初，由于發(fā)現(xiàn)m期細胞內有某種促進染色體凝集的因子（已知是m期促進因子，mpf），它無種屬特異性，所以在細胞融合和染色體制片技術的基礎上，建立了制備染色體提前凝集標本的方法。即讓m期細胞與間期細胞融合，從而誘導g1、s、g2期細胞的染色質提前濃縮成染色體。形成的這種染色體稱提前凝集的染色體（prematurely condensed chromosome，pcc）。這項技術已應用于細胞周期分析、正常細胞和腫瘤細胞染色體的微細結構的研究、多種因素作用細胞使染色體損傷及修復效應的研究，預測某種血液病的病程、預后及復發(fā)的臨床實踐等方面。實驗用品1. 材料：人宮頸癌上皮細胞（hela

3、細胞）2. 器材：顯微鏡、離心機、水浴箱、吹風機、10 ml刻度離心管、5ml注射器、試管架、染色缸、吸水紙、擦鏡紙、冰凍載玻片、記號筆、酒精燈。3. 試劑：50peg、hanks液（ph7.4）、rpmi-1640（含10滅活小牛血清，ph7.4）、10µg/ml秋水仙素、0.075m kcl低滲液、1/15m pbs、carnoy固定液、giemsa染液。實驗內容及方法 一、收集培養(yǎng)的m期的hela細胞1. 向對數(shù)生長期的 hela細胞培養(yǎng)基中加入10µg/ml的秋水仙素，使終濃度為0.04µg/ml，在37二氧化碳培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)3小時，使大量生長

4、的細胞被阻斷于m期。2. 取一瓶經上述處理的細胞，輕輕傾去培養(yǎng)液，加入5ml hanks液，反復進行水平振搖，使培養(yǎng)液不斷沖刷細胞層（或用吸管吹打），m期細胞因變成球形容易脫離瓶壁而懸浮。將細胞懸液移入離心管中，計數(shù)備用。二、間期hele細胞的準備另取一瓶處于對數(shù)生長期的細胞，也可采用收集過m期細胞后的貼壁細胞，用0.25的胰蛋白酶消化23分鐘，棄去消化液，加入5 ml hanks液，用吸管吹打成細胞懸液，計數(shù)備用。三、50peg的制備稱取0.5g peg（mw4000），倒入離心管中，在酒精燈上加熱使之融化，再加入預熱的hanks液0.5 ml，混勻后放在37水浴中待用。四、細胞融合1. 將

5、 m期和間期 hela細胞按 11（各約為 106個）混合于離心管中，1 000rpm離心5min，棄上清液，用hanks液洗滌離心一次，再棄上清液，離心管倒置在濾紙上吸盡殘液。2. 用彈指法彈散細胞，在37水浴條件下吸取0.5ml 50peg，逐滴加人離心管內，并不斷輕輕搖動，整個過程約90秒鐘，然后迅速加入5ml hanks液，以終止 peg的作用，在37水浴中靜置 510分鐘。然后以1 000rpm離心，去上清液，再用5ml hanks液洗滌，離心一次，充分去除peg。3. 棄去上清，加入2ml有血清的 rpmi-1640培養(yǎng)液，輕輕吹打成懸液，37水浴中溫育3060分鐘。pcc一般從融

6、合后10min開始，50min左右達到高峰。    五、制備pcc標本1. 細胞溫育后，以1 000rpm離心5分鐘，棄去上清夜，加入10ml kcl低滲液制成懸液，37處理3045分鐘。2. 加入1 ml carnoy固定液進行預固定，1 000rpm離心8分鐘，棄掉上清，彈散離心管底部細胞。3. 加10 ml carnoy固定液固定30分鐘，1 000rpm離心5分鐘，棄上清，留0.2 ml固定液。4. 用吸管吹打制成細胞懸液，取冰水載玻片滴片，吹風機烤干后，giemsa染色15分鐘，流水沖洗，干燥后鏡檢。由于處于間期不同時相的細胞均能與m期細胞融合而被誘導產生pcc，因此，有三種不同形態(tài)特點的提前凝集染色體：g1期pcc、s期pcc、g2期pcc。其形態(tài)特點分別是：g1期pcc為細長的單線染色體，著色淺，呈蓬松的線團狀；s期pcc由于染色體解旋，dna以多點進行復制，復制后的部分著色較深，以雙線染