實(shí)驗(yàn)室常用分離方法

1、精品文檔柱層析（ 適用于兩種極性相差比較大的物質(zhì)的分離 ）1 一，定義2二，裝柱方法3三，上樣方法 1 一，定義編輯（chromatography） 柱層析技術(shù)又稱柱色譜技術(shù)。在圓柱管中先填充不溶性基質(zhì)，形成 一個(gè)固定相。將樣品加到柱子上，用特殊溶劑洗脫，溶劑組成流動(dòng)相。在樣品從柱子上洗脫下來的過程中，根據(jù)樣品混合物中各組分在固定相和流動(dòng)相中分配系數(shù)不同，經(jīng)多次反復(fù)分配將組分分離。12二，裝柱方法編輯裝柱子（添硅膠）時(shí)，有兩種方法：即濕法裝柱和干法裝柱，二者各有優(yōu)劣。不論干法還是濕法，硅膠（固定相）的上表面一定要平整，并且硅膠（固定相）的高度一般為15cm左右，太短了可能分離效果不好，太長(zhǎng)了也

2、會(huì)由于擴(kuò)散或拖尾導(dǎo)致分離效果不好。濕法裝柱是先把硅膠用適當(dāng)?shù)娜軇┌鑴蚝?，再填入柱子中，然后再加壓用淋洗劑“走柱子”，本法最大的?yōu)點(diǎn)是一般柱子裝的比較結(jié)實(shí)，沒有氣泡。干法裝柱則是直接往柱子里填入硅膠，然后再輕輕敲打柱子兩側(cè)， 至硅膠界面不再下降精品文檔為止，然后再填入硅膠至合適高度，最后再用油泵直接抽，這樣就會(huì)使得柱子裝的很結(jié)實(shí)。 接著是用淋洗劑 “走柱子”，一般淋洗劑是采用 TLC分析得到的展開劑的比例再稀釋一倍后 的溶劑。通常上面加壓，下面再用油泵抽，這樣可以加快速度。干法裝柱較方便，但最大的 缺陷在于“走柱子”時(shí)，由于溶劑和硅膠之間的吸附放熱（可以用手摸柱子明顯感覺到），容易產(chǎn)生氣泡，這一

3、點(diǎn)在使用低沸點(diǎn)的淋洗劑時(shí)如乙醚，二氯甲烷更為明顯。雖然產(chǎn)生的氣泡在加壓的情況下不易察覺，但是，一旦撤去壓力，如在上樣、加溶齊峙操作的時(shí)候，氣泡 就會(huì)釋放出來，嚴(yán)重時(shí)，整個(gè)柱子變花，樣品不可能平整地通過，當(dāng)然也就談不上分離了。解決的辦法是：第一、硅膠一定要填結(jié)實(shí)；第二、一定要用較多的溶劑“走柱子”，一定要到柱子的下端不再發(fā)燙，恢復(fù)到室溫后再撤去壓力。也有介紹在硅膠的最上層填上一小層石英砂，防止添加溶劑的時(shí)候， 使得樣品層不再整齊。但我的感覺是如果小心上樣，添加溶劑，則沒有這個(gè)必要。3三，上樣方法編輯上樣也有干法和濕法之分：干法就是把待分離的樣品用少量溶劑溶解后，在加入少量硅膠，拌勻后再旋去溶劑。

4、 如此得到的粉末再小心加到柱子的頂層。干法上樣較麻煩，但可以保證樣品層很平整。濕法上樣就是用少量溶劑 （最好就是展開劑，如果展開劑的溶解度不好， 則可以用一極性較大的溶劑，但必須少量）將樣品溶解后，再用膠頭滴管轉(zhuǎn)移得到的溶液， 沿著層析柱內(nèi)壁均勻加入。然后用少量溶劑洗滌后，再加入。濕法較方便，熟手一般采用此法。上樣完畢后，接著即用淋洗劑淋洗。淋洗劑一般采用TLC分析得到的展開劑的比例再稀釋一倍后的溶劑。由于層析柱和薄板的不同，即使兩者使用的硅膠都相同，但是在把TLC分析得到的展開劑用在柱層析時(shí)，也顯得極性偏大，所以要稀釋一倍，但又不能稀釋太多， 否則成了靠擴(kuò)散作用來分離，效果也不會(huì)好。洗脫指利

5、用洗脫液中的物質(zhì)與待分離物質(zhì)或與配體的親和特性而將待分離物質(zhì)從親和吸附劑上洗脫下來。洗脫也可以分為兩種： 一種是選擇與配體有親和力的物質(zhì)進(jìn)行洗脫，另一種是選擇與待分離物質(zhì)有親和力的物質(zhì)進(jìn)行洗脫。前者在洗脫時(shí)，選擇一種和配體親和力較強(qiáng)的物質(zhì)加入精品文檔洗脫液，這種物質(zhì)與待分離物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)對(duì)配體的結(jié)合，在適當(dāng)?shù)臈l件下，如這種物質(zhì)與配體的親和力強(qiáng)或濃度較大， 配體就會(huì)基本被這種物質(zhì)占據(jù)，原來與配體結(jié)合的待分離物質(zhì)被取代而脫離配體，從而被洗脫下來。例如用凝集素作為配體分離糖蛋白時(shí)，可以用適當(dāng)?shù)膯翁窍疵摚瑔翁桥c糖蛋白競(jìng)爭(zhēng)對(duì)凝集素的結(jié)合，可以將糖蛋白從凝集素上置換下來。后一種方法洗脫時(shí)，選擇一種與待分離物質(zhì)有

6、較強(qiáng)親和力的物質(zhì)加入洗脫液，這種物質(zhì)與配體競(jìng)爭(zhēng)對(duì)待分離物質(zhì)的結(jié)合，在在適當(dāng)?shù)臈l件下，如這種物質(zhì)與待分離物質(zhì)的親和力強(qiáng)或濃度較大，待分離物質(zhì)就會(huì)基本被這種物質(zhì)結(jié)合而脫離配體，從而被洗脫下來。例如用染料作為配體分離脫氫酶時(shí)，可以選擇 NAD進(jìn)行洗脫，NAD是脫氫酶的輔酶，它與脫氫酶的親和力要強(qiáng)于染料， 所以脫氫酶就會(huì)與 NAD+吉合而從配體上脫離。特異性洗脫方法的優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)，可以進(jìn) 一步消除非特異性吸附的影響，從而得到較高的分辨率。另外對(duì)于待分離物質(zhì)與配體親和力 很強(qiáng)的情況，使用非特異性洗脫方法需要較強(qiáng)烈的洗脫條件，很可能使蛋白質(zhì)等生物大分子變性，有時(shí)甚至只能使待分離的生物大分子變性才能夠洗脫下來，使用特異性洗脫則可以避免這種情況。由于親和吸附達(dá)到平衡比較慢，所以特異性洗脫