中藥軟肝飲對CCl4誘導的肝纖維化大鼠TGF-1Smad信號通路的影響

1、中藥軟肝飲對CCl4誘導的肝纖維化大鼠TGF-1/Smad信號通路的影響    【摘要】  目的研究中藥軟肝飲對CCl4誘導的大鼠肝纖維化肝臟TGF-1及Smad3，Smad7表達的影響，探討其抗纖維化的作用機制。方法Wistar 大鼠40只，隨機分成正常對照組，模型對照組，軟肝飲治療組，鱉甲軟肝片對照組，采用CCl4背部皮下注射構建肝纖維化模型，行HE和VG染色，光鏡下觀察肝組織肝纖維化程度。同時免疫組化SABC方法檢測各組 TGF-1、Smad3和Smad7的表達。結果與正常對照組相比，模型組TGF-1、Smad3表達明顯增強，Smad7表

2、達明顯下降。經(jīng)軟肝飲治療后大鼠肝臟TGF-1表達比模型組減弱。軟肝飲同時下調Smad3的表達，上調Smad7的表達。另外，軟肝飲組大鼠肝臟病理變化顯著改善。結論肝炎平對大鼠肝纖維化肝臟TGF-1/Smad信號通路有明顯的影響，能抑制CCl4誘導的大鼠肝纖維化，其作用機制可能為抑制TGF-1表達，下調 Smad3及上調Smad7的表達?！娟P鍵詞】  軟肝飲；TGF-1/Smad信號通路；肝纖維化Abstract: Aim To study the effects of Ruanganyin on TGF-1，Smad3，Smad7 expressions of the experime

3、ntal hepatic fibrosis induced by carbon tetrachloride (CCl4) in rats，and to explore its anti-fibrotic molecular mechanism.Method Forty healthy Wistar rats were randomly divided into normal control group，vacant control group，CCl4-induced hepatic fibrosis group，and Ruanganyin treated group.The rats in

4、 normal group were treated with normal saline by intragastrical irrigation，and the other groups were subcutaneous injected with CCl4 to establish hepatic fibrosis model.The histological changes of the liver tissues were examined by pathological examination.The protein expression of transforming grow

5、th factor beta 1 (TGF-1) and Smad3,Smad7 were measured by immunohistochemical technique.Result In comparison with those inmodel group，the levels of TGF-1 were significantly decreased after treatment with Ruanganyin.Meanwhile，the levels of Smad3 was also down-regulated.However，the level of Smad7 expr

6、ession was significantly up-regulated.The pathological changes of liver tissues in Ruanganyin groups were also markedly alleviated.Conclusion Ruanganyin has significant inhibitory effects on CCl4-induced hepatic fibrosis in rats，and its mechanism may be associated with the inhibition of TGF-1 expres

7、sion，down-regulation of Smad3 expression and up-regulation of Smad7 expression.Key words: Ruanganyin；TGF-1/Smad signaling pathway；hepatic fibrosis    肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是多種原因引起的慢性肝損傷的共同病理改變，其特征是纖維增生和降解不平衡，纖維組織在肝臟過度沉積的結果1。研究證實，肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSC)活化和轉型在肝纖維化中發(fā)揮關鍵作用，HS

8、C的激活在HF發(fā)生、發(fā)展中處于中心地位2-3。而TGF-b是促進肝纖維化發(fā)展的最重要的細胞因子之一,它可與肝星狀細胞表面的受體結合,通過激活Smad通路,從而促進膠原等細胞外基質的合成和分泌4。Smad家族是TGF-b1細胞內傳導的通道，有研究發(fā)現(xiàn)5-6TGFb-Smad信號轉導通路在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，軟肝飲的抗纖維化作用亦可能與TGF-1/Smad信號通路有關，為了探討其抗肝纖維化作用的機制，我們采用CCl4誘導大鼠肝纖維化模型，用免疫組化方法檢測TGF-1、Smad3、Smad7的表達，觀察軟肝飲對肝纖維化時肝臟TGF-1/Smad信號通路的影響。1  材料和方

9、法1.1  材料 動物：同一品系清潔級健康Wistar大鼠40只，雄性，質量(130150g)及普通飼料均由安徽中醫(yī)學院實驗動物中心提供。藥品和主要試劑：（1）軟肝方(組成:鱉甲50g、黃芪50g、柴胡25g、丹參50g、川芎34g、莪術34g)由本院藥劑科提供，臨用前用雙蒸水稀釋成不同濃度備用。（2）CCl4，購自南京建成生物有限公司（批號：10006418）。（3）鱉甲軟肝片由內蒙古福瑞中蒙藥科技股份有限公司生產（批號：20061106），研制成粉末，雙蒸水溶解成含藥1ml/100g（0.6g/kg）混懸液。（4）TGF-1、Smad3、Smad7免疫組化試劑盒均購自武漢博士德生

10、物工程有限公司。（5）花生油，購自超市。2  方法2.2.1  分組 將40只Wistar大鼠（雄性、體重量130150g）隨機分成4組:正常對照組10只,CCl4肝纖維化模型組10只，軟肝飲治療組10只，陽性（鱉甲軟肝片）對照組10只。2.2.2  動物模型制備 將CCl4與高壓滅菌花生油按1：9比例配成10%油劑，第14周，除正常組外，其他各組大鼠按0.5ml/100g背部皮下注射10% CCl4花生油溶液，每周兩次。513周，正常組和CCl4肝纖維化模型組給予生理鹽水，軟肝飲組大鼠每天給予軟肝飲灌胃1次,劑量為2.0g/kg大鼠體重(相當于臨床用藥量的16倍

11、)。陽性對照組每天給與鱉甲軟肝片1ml/100g（0.6g/kg）灌胃1次。各組動物每周稱重一次，根據(jù)體重變化調整給藥量。第13周末，末次給藥24h后，全部大鼠股動脈放血處死,留取血液及全部肝臟,每只大鼠取相同部位肝臟用10%中性甲醛固定,剩余-80°C低溫冰箱保存;血液1500rpm離心后取血清置于-80°C低溫冰箱保存。2.3  免疫組化半定量判斷指標 光鏡下觀察肝臟病理變化并參照王寶恩等7肝纖維化分級法進行膠原纖維增生程度半定量分析。免疫組化SABC(即鏈酶親和素-生物素-酶復合物Strept-Avidin-Biotin-Complex)法檢測TGF-1、S

12、mad3、 Smad7，結果判定:采用Bresalier8半定量公式稍加修改判斷染色結果。切片在10倍物鏡視野下觀察，隨機計數(shù)5個視野中各染色強度細胞數(shù)的百分比。根據(jù)細胞染色強度分為四級，并分別計分；陰性，細胞無著色(0分)；弱陽性，細胞著色為淺黃色(1分)；中度陽性，細胞著色為棕黃色(2分)；強陽性，細胞著色為棕褐色(3分)，計算每一強度的視野數(shù)，根據(jù)下列公式計算每張切片的平均染色強度:IS(intensity score)=(0×F0)+(1×F1)+(2×F2)+(3×F3)，F(xiàn)i=10×視野數(shù)(i=0，1，2，3)。2.4 

13、統(tǒng)計學處理 用SPSS11.0軟件包統(tǒng)計分析，計量資料以mean±SD表示，方差齊用多組間均數(shù)兩兩比較用單因素方差分析，LSD法，方差不齊用秩和檢驗，多樣本兩兩比較用Nemenyi法進行統(tǒng)計分析，雙側a=0.05為顯著性檢驗水準。    3  結果3.1  病理組織學改變 正常組肝細胞以中央靜脈為中心向四周呈放射狀排列，結構正常。模型組肝組織病理損害嚴重，正常結構被破壞，肝索排列紊亂，肝細胞明顯腫脹變性，其中多為脂肪變性，肝小葉中央?yún)^(qū)明顯壞死。間質內有炎性細胞浸潤，膠原增生顯著，增生結締組織分割肝小葉，接近形成假小葉。軟肝飲

14、治療組與模型組相比，肝組織結構破壞不明顯，肝細胞脂肪變性程度顯著減輕，可見少量炎性細胞浸潤，肝細胞壞死減輕，少見纖維結締組織增生(圖1A，B)。3.2  免疫組化結果 TGF-1在正常組肝組織肝竇處有陽性著色，與正常組比較模型組TGF-1表達明顯增強(P<0.05)，主要分布于纖維組織增多的區(qū)域以及匯管區(qū)、肝血竇、壞死灶等處，以纖維隔中炎性細胞胞質及其周圍多見，提示肝臟間質細胞是TGF-1的主要來源細胞(圖2A)。軟肝飲治療組陽性染色程度較模型組明顯減輕(P<0.05)，纖維隔中炎性細胞胞質陽性染色明顯減少(圖2B)。3.3  各組大鼠肝組織Smad3和Smad

15、7的表達 正常對照組肝組織可見少量Smad3弱陽性表達，主要分布于血管壁;模型組Smad3強陽性表達細胞數(shù)明顯增多，主要分布于纖維化匯管區(qū)及纖維間隔里的梭型細胞間質和部分肝實質細胞的胞質；各治療組肝組織中僅梭型細胞間質的Smad3呈中度陽性表達(圖3A)。其中模型組陽性表達細胞的平均染色強度積分明顯高于各治療組(圖3B)，二者比較均，P<0.05；各治療組smad3陽性表達細胞平均染色強度積分比較，P>0.05二者無顯著性差異。Smad7在正常對照組大鼠肝臟組織僅少量陽性表達;模型組肝實質細胞呈弱陽性表達(圖4A)，各治療組大鼠肝臟實質細胞廣泛表達Smad7 (圖4B)。其中模型組

16、Smad7陽性表達細胞平均染色強度積分明顯低于各治療組，分別比較二者均P<0.05；各治療組陽性表達細胞平均染色強度積分比較，P>0.05無顯著性差異(表1)。表1  大鼠肝組織TGF-1，Smad3，Smad7的表達(略)4  討論    轉化生長因子-1（TGF-1）是影響活化肝星狀細胞（HSC）、促進膠原等細胞外基質合成，加劇纖維化形成的主要生物因子，活化后的TGF-1結合于特異性受體后進入信號轉導途徑，發(fā)揮其生物學作用。迄今為止，Smad蛋白是TGF-1受體胞內激酶的唯一底物，它既是胞內信號分子，又有轉錄激活作用。Smad蛋

17、白家族中的Smad3與Smad7是TGFb 受體后信息分子，參與調控細胞的增生、轉化、合成、分泌和凋亡。其中Smad3是HSC活化的重要媒介，而Smad7是TGFb信號的拮抗因子9。    祖國醫(yī)學認為，氣虛血滯為肝纖維化之本，濕毒熱邪稽留血分為標，肝無血養(yǎng)而失柔，治則要以活血益氣、養(yǎng)血柔肝為基礎，如余邪未清，佐以祛邪。軟肝飲主要由黃芪、丹參、莪術、鱉甲、柴胡等多味中藥組成，具有活血化瘀、益氣散結、疏肝利膽的功效，正是針對肝纖維化的病理環(huán)節(jié)組方。本結果顯示，軟肝飲治療組肝纖維化程度較模型組明顯減輕，軟肝飲能夠顯著抑制TGF-1，拮抗胞內關鍵信號分子Smad3，上調

18、Smad7的表達。目前認為，阻斷TGF-1的合成和信號是抗纖維化治療的主要目標，隨著細胞生物學的發(fā)展，開展了在多種水平上抑制TGF-1的嘗試。其中中草藥具有多途徑、多靶點,本研究表明，軟肝飲可多層次、多靶點通過TGF-1/Smad信號通路發(fā)揮作用從而抑制肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展，這可能是其抗肝纖維化作用的重要機制?！緟⒖嘉墨I】  1Friedman SL.Liver fibrosis - from bench to bedsideJ.J Hepatol 2003,38(Suppl):S38-53.2Reeves HL，F(xiàn)riedman SL.Activation of hepatic s

19、tellate cells-a key issue in liver fibrosisJ.Front Biosc,2002,7:d808-826.3Gressner AM，Weiskirchen R.Modern pathogenetic concepts of liver fibrosis suggest stellate cells and TGF-beta asmajor players and therapeutic targetsJ.J Cellmolmed,2006,10:76-99.4張立煌,劉翠雪,姚航平,等.轉化生長因子-b1及其受體的表達與大鼠肝纖維化關系的研究J.浙江大學學報(醫(yī)學版)2000,29(3):97-100.5Kitamura Y，Ninomiya H.Smad expression of hepatic stellate cells in liver cirrho