乙肝小三陽血清HBVDNA定量檢測及其與前S1關(guān)系的研究

1、乙肝小三陽血清HBVDNA定量檢測及其與前S1關(guān)系的研究    摘nbsp;nbsp;要nbsp;目的：檢測乙型肝炎小三陽患者HBVDNA含量，并與前S1抗原(PreS1)進行比較分析。方法：收集351例乙型肝炎小三陽患者血清和30例正常體檢者血清，用ELISA方法檢測前S1抗原，用熒光定量PCR方法定量檢測HBVDNA。結(jié)果：HBsAg、抗HBe、抗HBc     摘  要 目的：檢測乙型肝炎小三陽患者HBVDNA含量，并與前S1抗原(PreS1)進行比較分析。方法：收集351例乙型肝炎小三陽患者血清和

2、30例正常體檢者血清，用ELISA方法檢測前S1抗原，用熒光定量PCR方法定量檢測HBVDNA。結(jié)果：HBsAg、抗HBe、抗HBc陽性(小三陽)患者HBVDNA檢出率為62.7%(4.5×106 copiesml)，前S1抗原檢出率為72.9%。結(jié)論:HBeAg轉(zhuǎn)陰者也存在病毒復制，HBVDNA與前S1抗原相關(guān)性較好，對于乙型肝炎患者在常規(guī)血清學標志物檢測的基礎(chǔ)上對HBVDNA數(shù)量進行動態(tài)檢測有助于臨床診斷、療效觀察及預(yù)后判斷。    關(guān)鍵詞 乙型肝炎；HBVDNA；前S1抗原    Study the

3、 Relationship of HBVDNA Quantitatively Detection and PreS1 for the  Patients of Hepatitis B with Positive of HBsAg、AntiHbe and AntiHBc    LI Qiang,ZHANG Jianyuan,PANG Xueyun,LIU Ruiping    (The Second Clinical Medical College of Guangzhou University of Tr

4、aditional Chinese Medicine,Guangzhou，Guangdong 510120,China)    Abstract：Objective To determine hepatitis B virusDNA(HBVDNA) and pre S1 antigen in patients with hepatitis B and expolore their different clinical values.Methods 351 positive serum of HBsAg,antiHBe,antiHBc of hepatit

5、is B and 30 healthy man wrer collected.PreS1 antigen and HBV markets were detected with ELISA and HBVDNA with fluorescent quantitative PCR(FQPCR) respectively.Results The positive rates of HBVDNA and PreS1 antigen were 62.7%(4.5×106 copiesml)、72.9% respective in patients with hepatitis B of whi

6、ch HBsAg、antiHBe、antiHBc were positive.Conclusion There were replication of virus in patients with HBeAg negative,The serum levels of HBVDNA of patients with hepatitis B closely correlate PreS1.HBVDNA with fluorescent quantitative PCR for the patients with hepatitis B is helpful to clinical diagnosi

7、s、clinical evalution and prognosis.    Key words：Hepatitis B；HBVDNA；PreS1 antigen    乙型肝炎血清標志物的檢測方法有多種，尋求快速、敏感和特異性檢測手段具有十分重要的意義。前S1(PreS1)抗原已成為HBV感染、復制和乙肝患者診斷、治療和預(yù)后的一個重要標志，但存在“窗口期”及“免疫逃避株”等問題。乙型肝炎病毒HBVDNA含量是判斷病毒復制活躍和具有傳染性的直接可靠依據(jù)，HBVDNA定量測定可以反映乙型肝炎病毒(HBV)的量的變化，

8、直接檢測患者血清中病毒的拷貝數(shù)量，反映患者病毒血癥的水平。本研究觀察了乙肝小三陽患者血清標志物、前S1和HBVDNA三者之間的相關(guān)性，探討了HBVDNA檢測的臨床意義,現(xiàn)報道如下。    1  材料與方法    1.1  標本  收集我院351例乙型肝炎小三陽患者血清,其中男273例，平均年齡30.1歲，女78例，平均年齡32.3歲，健康對照30例,男25例，平均年齡33.8歲，女5例，平均年齡34.6歲。留取清晨空腹靜脈血，分離血清，-20 保存待檢。  

9、0; 1.2  儀器  RSP150/8全自動加樣器(瑞士TECAN公司生產(chǎn))，BEP全自動酶免疫分析儀(德國DadeBehring公司生產(chǎn))，美國ABI公司AB770型PCR熒光定量儀。    1.3  方法    1.3.1  血清標志物(HBsAg、抗HBs、HBeAg、抗HBe、抗HBc)檢測  應(yīng)用ELISA方法，試劑由上海實業(yè)科華生物技術(shù)有限公司提供，試劑批號分別為：20060718、20061013、20060913、20060925、200

10、60924。用瑞士TECAN公司生產(chǎn)的加樣器(RSP150/全自動酶免分析儀)進行加樣(包括質(zhì)控血清、陰陽性對照及待檢血清)，然后用BEP全自動酶免疫分析儀進行檢測，判定方法嚴格按照說明書進行。    1.3.2  前S1抗原檢測  采用雙抗體夾心ELISA法，用抗前S1和抗HBs作為固相化抗體和酶標抗體，單抗捕獲待檢標本中的乙肝病毒表面抗原，用辣根過氧化物酶標記的抗PreS1單抗作為檢測抗體。嚴格按照試劑盒說明書的檢測步驟進行操作，根據(jù)酶底物反應(yīng)后的呈色吸光值，測定血清中乙肝病毒PreS1，試劑由上海阿爾法生物技術(shù)有限公司提供，試劑

11、批號：20060601。    1.3.3  HBVDNA定量測定  采用PCR方法結(jié)合熒光探針體外擴增和檢測技術(shù)，試劑由深圳匹基生物工程股份有限公司，該試劑盒的檢測下限為5.0×108 copiesml，試劑批號：20060301。    1.4  統(tǒng)計分析計數(shù)資料  采用配對計數(shù)資料卡方檢驗，所有數(shù)據(jù)用SPSS 11.5處理。    2  結(jié)果    2.1  H

12、BsAg、抗HBe、抗HBc陽性組(小三陽組)  HBVDNA檢出率為62.7%,其HBVDNA平均含量為4.5×106 copiesml；前S1抗原檢出率為72.9。可見部分HBeAg轉(zhuǎn)陰患者仍存在病毒高復制。30例健康對照者血清HBV標志物、HBVDNA及前S1均為陰性，結(jié)果見表1。    表1  351例乙肝小三陽患者血清HBVDNA及前S1抗原檢測結(jié)果(略)    2.2  乙型肝炎小三陽患者PreS1與HBVDNA的關(guān)系  351例乙型肝炎小三陽患者血清中

13、，HBVDNA陽性為220例，PreS1陽性為256例，其陽性檢出率分別為62.7%(220351)、72.9%(256351)。HBVDNA陽性組中PreS1檢出率為77.3%(170/220)，HBVDNA陰性組中PreS1檢出率為65.6%(86/131)，PreS1與HBVDNA檢出率不一致，HBVDNA與PreS1檢出率差異有統(tǒng)計學意義(2=18.4，P<0.05)，見表2。    表2  乙型肝炎小三陽患者血清PreS1與HBVDNA的關(guān)系(略)    3  討論 &

14、#160;  HBV血清標志物檢測是目前診斷乙肝最常用的指標，它主要反映人體對乙肝病毒的免疫反應(yīng)狀態(tài)，不能直接反映HBV在患者體內(nèi)的復制情況。由于HBV血清標志物復雜多樣，臨床上難以根據(jù)這些結(jié)果對HBV感染復制情況進行準確判斷。HBV的外衣殼蛋白包括S蛋白、前S1蛋白和前S2蛋白，研究顯示，前S1蛋白含有肝細胞膜受體，與病毒侵入肝細胞以及HBV復制關(guān)系密切1。PreS1作為病毒復制的標志物之一被廣泛應(yīng)用于臨床。ELISA抗原檢測方法一般需要10151017個病原體才可檢測出陽性，而病毒感染后“窗口期”則會出現(xiàn)假陰性結(jié)果。熒光定量PCR技術(shù)的出現(xiàn)，解決了病原體感染后的發(fā)病時間

15、、病情輕重與病原體數(shù)量的關(guān)系2。探討HBV血清標志物、前S1、HBVDNA檢測及其相互間的關(guān)系對于乙型肝炎臨床診斷、療效觀察和預(yù)后判斷具有重要意義。本研究采用ELISA及FQPCR方法檢測351例乙型肝炎小三陽患者血清標本的前S1、HBVDNA，結(jié)果顯示小三陽患者血清中HBVDNA檢出率達62.7%。HBVDNA平均含量為9.5×105 copiesml；PreS1檢出率為72.9%。通常認為HBeAg陽性是HBV復制活躍的指標之一，本研究結(jié)果表明HBeAg陰性并不表明HBV復制的完全終止或病毒血癥的消失，該結(jié)果和Pichoud等3的報道基本一致，病毒拷貝數(shù)與HBeAg陽性相比明顯下

16、降，表明在HBV感染者體內(nèi)HBeAg向抗HBe血清轉(zhuǎn)換的動態(tài)過程中，病毒的復制逐漸減少。前S1與HBVDNA檢出率并不一致，可能是前S1和HBVDNA檢測所表達的意義并不完全一致，慢性乙型肝炎病程早期(HBsAg陽性)，HBVDNA陽性而PreS1陰性；病程后期，部分病例PreS1陽性而HBVDNA為陰性。因此，不能僅依照PreS1來判斷病毒是否復制，PreS1不能完全代替HBVDNA的檢測，只能作為其補充的指標。傳統(tǒng)觀念認為慢性乙肝患者出現(xiàn)HBeAg轉(zhuǎn)陰或轉(zhuǎn)為HBeAb陽性后傳染性小，病情好轉(zhuǎn)，常作為抗病毒治療有效的指標。本研究表明，HBeAg陰性乙肝小三陽患者血清采用敏感的DNA信號擴增法

17、約40%可檢出病毒活動性復制，其中約70%為HBV前C/C區(qū)變異的突變株4，5，而對于HBeAg陰性慢性乙肝患者，是否存在HBVDNA復制是判斷病情與預(yù)后、衡量抗病毒療效的關(guān)鍵指標。有研究認為前S1抗原與HBV復制有更密切關(guān)系，PreS1作為病毒復制的重要指標，較HBeAg敏感。在本研究中，PreS1與HBVDNA高度相關(guān)，表明PreS1與HBV的復制具有一致性，但HBVDNA陽性組中PreS1檢出率為77.3%，和HBVDNA的檢出率差異有顯著性，因此認為臨床上判斷病毒的復制及其活躍程度不能單靠HBeAg或PreS1是否陽性，準確的方法是熒光定量PCR方法對HBVDNA進行定量檢測。血清中H

18、BVDNA的量是反映病毒復制的最直接標志，是評價傳染性的最可靠的方法，熒光定量PCR技術(shù)能從DNA水平鑒別其潛伏性和活動性，可以作為HBV感染的分子診斷標準因此對于乙型肝炎病毒感染者，在常規(guī)血清學標志物檢測的基礎(chǔ)上，采用FQPCR方法對HBVDNA數(shù)量進行動態(tài)觀測，對乙型肝炎的診斷、抗病毒治療的藥物療效評價、指導乙型肝炎合理治療方案的制訂以及預(yù)后判斷有非常重要的意義。    參考文獻：    1  盧建華，宋晨朝，郎振為，等前S1蛋白檢測在慢性乙型肝炎患者病理診斷中的價值J中華傳染病雜志，2006，24(1)：6062.    2  姚磊，潘海龍，張征，等59 434例就診者血清乙肝病毒標志物的檢出與分析J重慶醫(yī)學，2003，32(4)：469.