初發(fā)急性非淋巴細胞白血病SSBP2 mRNA表達研究

1、初發(fā)急性非淋巴細胞白血病SSBP2 mRNA表達研究【摘要】nbsp;nbsp;目的：探討SSBP2nbsp;mRNA在初發(fā)急性非淋巴細胞白血病中的表達。方法：利用半定量RTPCR檢測64nbsp;例初發(fā)急性非淋巴細胞白血病患者及20nbsp;例正常對照SSBP2nbsp;mRNA表達，以actin作為內(nèi)參照。結(jié)果：64nbsp;例初發(fā)ANLL患者及20nbsp;例正 作者：劉偉，王宏偉，郭慧敏，李秋杏，覃艷紅，朱 鐳，張 麗作者單位：(山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，山西 太原 030001) 【摘要】 目的：探討SSBP2 mRNA在初發(fā)急性非淋巴細胞白血病中的表達。方法：利用半定量RTPCR檢測6

2、4 例初發(fā)急性非淋巴細胞白血病患者及20 例正常對照SSBP2 mRNA表達，以actin作為內(nèi)參照。結(jié)果：64 例初發(fā)ANLL患者及20 例正常對照均表達SSBP2。與正常對照比較，初發(fā)ANLL患者SSBP2 mRNA表達水平為(0.4100.216)與對照組(0.3830.172)差異無顯著性(P0.05)。結(jié)論：初發(fā)ANLL中SSBP2 mRNA表達無異常改變，SSBP2表達可能并不參與急性非淋巴細胞白血病的發(fā)生。 【關(guān)鍵詞】 白血??；急性；單鏈DNA結(jié)合蛋白2；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) The expression of SSBP2 mRNA in primary acute nonlymp

3、hocytic leukemia LIU Wei，WANG Hongwei，GUO Huimin，LI Qiuxing，QING Yanhong，ZHU Lei，ZHANG LI (The Second Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China) Abstract Objective：To explore SSBP2 mRNA level in primary acute myeloid leukemia patients.Methods：Reverse transcription Polymerase chain r

4、eaction(RTPCR) was used to assay the expression level of SSBP2 mRNA in 64 cases of primary acute myeloid leukemia(ANLL)and 20 normal cases，actin was used as contral gene.Results：SSBP2 was normally expressed in 64 cases of primary ANLL and 20 normal cases.The SSBP2 mRNA level in primary ANLL(0.4100.2

5、16) was no statistically significant difference compared with in normal cases(0.3830.172)(P0.05)。Conclusions：Expression of SSBP2 mRNAwas not changed in the primary ANLL patients，expression of SSBP2 may be not involved in the development of ANLL. Key word leukemia；acute；singlestranded DNAbinding prot

6、ein 2；RTPCR 急性非淋巴細胞白血病(ANLL)是骨髓造血干細胞的惡性克隆增生性疾病，基因損傷是ANLL的常見現(xiàn)象。單鏈DNA結(jié)合蛋白2(singlestranded DNA binding protein 2，SSBP2)能夠抑制細胞異常增殖，誘導(dǎo)細胞的分化，Qian1等在治療14 例相關(guān)性AML的患者中檢測出9 例表現(xiàn)為SSBP2表達下調(diào)，但在初發(fā)ANLL中的表達目前還不很明了。為此我們利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR)半定量檢測64 例初發(fā)ANLL患者SSBP2 mRNA表達水平，報告如下。 1 資料與方法 1.1 一般資料 收取2007年2月2007年12月初診ANLL 64

7、 例，其中男36 例，女28 例，年齡1169 歲。FAB分型：M0 1 例，M2 18 例，M3 32 例，M4 7 例，M5 5 例，M7 1 例，所有入選病例均經(jīng)形態(tài)學(xué)、流式細胞術(shù)免疫分型聯(lián)合確診，且未進行臨床化療。正常對照選取非白血病患者20 例。 1.2 實驗方法 1.2.1 引物設(shè)計 利用Primer 5.0軟件設(shè)計引物，由北京奧科生物公司合成，SSBP2上游序列為5AATGGCTCTCTTTAGCTCAGGA3，下游序列為5CCAACCTTTTTATTTCCTGCTC3，擴增產(chǎn)物片段大小310bp。actin作為內(nèi)參基因，其上游序列為5GGAAATCGTGCGTGACATTAAG

8、3，下游序列為5GGACTCGTCATACTCCTGCTTG3，擴增產(chǎn)物片段大小478bp。 1.2.2 總RNA的提取 參照美國GENTRA公司總RNA提取試劑盒說明步驟提取，所提取總RNA經(jīng)紫外分光光度儀測定其260nm和280nm處的吸光度(A)值，選取A260/A280比值1.82.0者，以A260計算出濃度，用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。 1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 參照美國Ferments公司生產(chǎn)的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行操作。總反應(yīng)體積為20 L反應(yīng)步驟為總RNA 1 g，random primer 0.4 g，加DEPC水至11 L，705 min后置于冰上加入5buffer 4 L，10 mmol/L

9、 dNTP 2 L，RNasin 20 U，255 min置于冰上并加入200 U/L MMLV 1 L，2510 min，4260 min，7010 min結(jié)束反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物作PCR擴增用。 1.2.4 確定PCR線性擴增最佳反應(yīng)循環(huán)數(shù) 通過對SSBP2基因及actin基因同時進行24，26，28，30，32，34，36，38個循環(huán)數(shù)的擴增，2瓊脂糖凝膠電泳，利用美國UVP凝膠成像儀軟件檢測擴增產(chǎn)物灰度值，繪出線性曲線圖，選擇擴增產(chǎn)物在直線增長期的循環(huán)數(shù)為PCR實驗的循環(huán)數(shù)。 1.2.5 PCR實驗 反應(yīng)體系25 L，具體cDNA 1 L，10buffer 2.5 L，25 mmol/L M

10、gC 121.5 L，10 mmol/L dNTP 2.5 L，TaqDNA酶1.5 U(美國Ferments公司產(chǎn)品)，20 mol/L上游引物與下游引物各1 L，去離子水補足25 L。SSBP2基因及actin基因同批分管進行擴增，反應(yīng)條件為952 min，95 30 s，5530 s，7245 s，擴增26個循環(huán)后迅速取出actin基因反應(yīng)管，至28個循環(huán)結(jié)束后再迅速放入PCR儀，72共同總延伸10 min。為了排除PCR過程可能出現(xiàn)的假陽性，每次擴增均設(shè)立空白對照(以去離子水代替目的cDNA)。 1.2.6 PCR產(chǎn)物進行電泳及半定量分析 取SSBP2基因和actin基因PCR擴增產(chǎn)物

11、各3 L混入2 L上樣液，在2瓊脂糖凝膠中電泳，利用美國UVP凝膠成像儀拍攝電泳圖片檢測SSBP2基因與actin基因擴增產(chǎn)物灰度值。以SSBP2與actin灰度值的比值作為SSBP2 mRNA的相對表達量。 1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 SSBP2 mRNA表達量以s來表示，用SPSS13.0軟件進行分析。方法采用兩樣本t檢驗，P0.05表示差異有顯著性。 2 結(jié) 果 2.1 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果及PCR線性擴增最佳反應(yīng)循環(huán)數(shù)的確立 PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳驗證，擴增產(chǎn)物片段大小與預(yù)先設(shè)定大小一致，SSBP2與actin經(jīng)過24，26，28，30，32，34，36，38個循環(huán)擴增后檢測各個循環(huán)數(shù)

12、的PCR產(chǎn)物灰度值，通過作圖分析擴增最佳循環(huán)數(shù)，結(jié)果顯示actin內(nèi)參基因為26個循環(huán)，SSBP2基因為28個循環(huán)。 2.2 SSBP2 mRNA在ANLL患者與正常對照中的表達 64 例初發(fā)ANLL患者和20 例正常對照均表達SSBP2，初發(fā)ANLL患者的SSBP2 mRNA相對表達量為0.4100.216與對照組SSBP2 mRNA相對表達量0.3830.172比較差異無顯著性(P0.05)。 3 討 論 白血病是以造血干細胞分化受阻、克隆性細胞增殖異常以及凋亡抵抗為主要特征的惡性血液病。許多與細胞增殖、分化及凋亡有關(guān)的基因功能的改變參與了白血病的發(fā)生和發(fā)展。SSBP2是一個高度保守的轉(zhuǎn)錄

13、調(diào)控因子，可參與細胞周期的調(diào)控，介導(dǎo)細胞的分化。Liang等2發(fā)現(xiàn)HL60，TF1，U937，HEL等細胞株中SSBP2表達缺失，SSBP2可抑制髓系白血病細胞的惡性生長并誘導(dǎo)細胞分化，提示SSBP2在機體內(nèi)可能作為腫瘤抑制基因發(fā)揮生物學(xué)功能。部分治療相關(guān)性白血病患者存在SSBP2表達的下調(diào)，提示SSBP2基因異常可能是白血病形成的分子學(xué)機制之一。 本研究以actin作為內(nèi)參，利用半定量RTPCR技術(shù)檢測分析了64 例初發(fā)ANLL患者SSBP2基因的相對表達量。由于目的基因與內(nèi)參基因在細胞內(nèi)表達豐度不同，經(jīng)PCR擴增進入平臺期的循環(huán)數(shù)隨之不同，因此我們首先確定了線性擴增所需的最佳擴增循環(huán)數(shù)，保

14、證PCR擴增產(chǎn)物灰度值能夠反應(yīng)擴增基因的表達水平，同時為了避免同管擴增帶來的引物間競爭抑制，我們采用目的基因與內(nèi)參基因同批分管進行擴增，確保半定量分析的準確性。結(jié)果顯示初發(fā)ANLL患者與正常對照均表達SSBP2，并且兩組SSBP2表達量無顯著性差異，初發(fā)ANLL患者中SSBP2基因表達水平并無異常改變，提示SSBP2基因的表達可能不是參與初發(fā)ANLL發(fā)生的因素之一。 Qian等1研究發(fā)現(xiàn)部分相關(guān)性AML病例伴有SSBP2表達下調(diào)，而我們的研究證實SSBP2基因表達水平在初發(fā)且未經(jīng)化療的ANLL患者中并無異常改變，提示化療藥物在殺死腫瘤細胞的同時可能會影響到SSBP2的表達，進而干擾造血系統(tǒng)的正

15、常分化，誘發(fā)治療相關(guān)性白血病的形成3。白血病細胞株HL60，HEL，TF1，U937等存在SSBP2基因的表達缺失，K562和BVl73細胞株SSBP2則廣泛表達，說明SSBP2在不同類型細胞株中可能存在不同的作用機制，進一步分析其信號傳導(dǎo)途徑及其表現(xiàn)出的生物學(xué)功能將有助于深入了解SSBP2與ANLL的關(guān)系。 【參考文獻】 1 Qian Z，F(xiàn)enald A A，Godley L A，et al.Expression profiling of CD34hematopoietic stem/progenitor cells reveals distinct subtypes of therapyrelated acute myeloid leukemiaJ.Proc Natl Acad Sci