大鼠局灶性腦缺血后腦組織環(huán)氧酶-2蛋白的表達(dá)

1、    大鼠局灶性腦缺血后腦組織 環(huán)氧酶-2蛋白的表達(dá)        摘要：目的觀察大鼠持久性腦缺血不同時相過程中腦組織環(huán)氧酶-2蛋白的表達(dá)特性。方法采用線栓法大鼠大腦中動脈阻塞模型，以尾殼核平面為模板，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法觀察假手術(shù)組及缺血1、4、12、24和48 h組環(huán)氧酶-2蛋白陽性染色細(xì)胞的分布部位及數(shù)量。結(jié)果 正常對照組、假手術(shù)組、缺血1和4 h組均無陽性染色細(xì)胞，缺血12 h陽性染色細(xì)胞開始增多(46±19） 個/mm2,缺血24 h達(dá)到高峰(

2、70±14） 個/mm2，缺血48 h陽性細(xì)胞數(shù)量減少(41±13） 個/mm2，差異有顯著意義。陽性染色細(xì)胞僅見于額頂部大腦皮質(zhì)上部、扣帶皮質(zhì)中細(xì)胞形態(tài)完整的神經(jīng)元及血管內(nèi)皮細(xì)胞，而膠質(zhì)細(xì)胞并無著色。結(jié)論環(huán)氧酶-2蛋白主要由缺血半暗帶的神經(jīng)元和血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，缺血早期環(huán)氧酶-2蛋白并不表達(dá)，表達(dá)時間具有延遲性，提示其可能與遲發(fā)性神經(jīng)元損傷有關(guān)。關(guān)鍵詞：腦缺血； 前列腺素內(nèi)過氧化物合酶The expression of cyclooxygenase-2 in focal cerebral ischemia in ratsZHANG ZaiqiangLONG JieLU D

3、unyue（Department of Neurology, Tiantan Hospitol, Beijing 100050， China）Abstract：ObjectiveTo explore the characteristic of the expression of COX-2 protein in different intervals following permanent focal cerebral ischemia in rats. MethodsA model of the middle cerebral artery occlusion (MCAO) in rats

4、was performed with the intraluminal filament occlusion. The rats brains were cut in the coronal planes at the levels of the caudoputamen as the templates.The immunohistochemistry staining was used to facilitate the observation of the distributions and quantities of COX-2 protein in the brain tissues

5、 following the sham operation and the permannent MCAO for 1 h, 4 h,12 h, 24 h and 48 h respectively. ResultsThere were no immunochemistry positive staining among the control group,the sham operation group,and the beginning ischemic group with MCAO for 1 h and 4 h. However, a significant increase in

6、COX-2 immunostaining was detected 12 h after MCAO (46±19)/mm2. It was most marked 24 h (70±14)/mm2, by 48 h after MCAO the positive staining cells gradually decreased (41±13)/mm2. The difference among those groups was significant (P<0.01). The immunochemistry positive staining only

7、 occurred in the neurons and vascular endothelials in the upper frontoparietal cortices and cingulate gyri,whereas the gliocytes did not show positive staining. ConclusionThe induction of COX-2 protein was evident in neurons and vascular endothelials at the ischemic penumbra,and the characteristics

8、of the delayed expression indicated that it might involve in the mechanism of delayed neuronal death.Key words：Cerebral ischemia; Prostaglandin-endoperoxide synthase缺血后磷脂酶A2激活，促進(jìn)膜磷脂降解，大量形成花生四烯酸，后者在環(huán)氧酶作用下，代謝成為前列腺素和血栓烷素。目前，2種不同的環(huán)氧酶（COX）基因已被確定：COX-1呈結(jié)構(gòu)性表達(dá)，而COX-2的表達(dá)受炎性刺激和突觸膜激活的誘導(dǎo)。以往的實驗資料表明，腦缺血后腦實質(zhì)中前列腺素和

9、血栓烷素水平升高，這種增高的效應(yīng)可被預(yù)先應(yīng)用環(huán)氧酶抑制劑所阻斷；在短暫全腦缺血實驗中發(fā)現(xiàn)，環(huán)氧酶抑制劑可改善缺血神經(jīng)元損害，這就意味著花生四烯酸環(huán)氧酶途徑代謝產(chǎn)物在缺血神經(jīng)元中毒機(jī)制中具有重要作用。在本研究中，我們用免疫組化方法對大鼠持久性腦缺血不同時相過程中腦組織環(huán)氧酶-2蛋白的表達(dá)進(jìn)行了觀察?，F(xiàn)報道如下。材料和方法1.實驗動物：Wistar雄性大鼠55只，體重250300 g，月齡2.53.0個月，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物研究所提供。隨機(jī)將大鼠分為正常對照組、腦缺血1、4、12、24及48 h組，缺血組各配1個假手術(shù)組，每組5只。2.大鼠大腦中動脈阻斷局灶性腦缺血模型：參照Longa等1的線栓

10、法，略有改進(jìn)，栓線采用直徑0.22 mm尼龍魚線，頭端5 mm膨大(直徑約0.250.28 mm)。栓線從頸外動脈與頸總動脈分叉處進(jìn)線約20 mm遇阻即止；全部大鼠均栓塞右側(cè)大腦中動脈。假手術(shù)組栓線進(jìn)入15 mm,于各時間點斷頭取材。統(tǒng)一采用尾殼核平面腦切片(視神經(jīng)末端冠切)2作為觀察對象。3抗體：COX-2抗體(山羊抗鼠IgG,Santa Cruz公司)，稀釋度為1100，二抗生物素化兔抗山羊IgG(Santa Cruz公司)，抗體稀釋度為1100。4.免疫組化染色方法：標(biāo)本組織常規(guī)酒精脫水透明、石蠟包埋，切片5 m 厚，采用免疫組化ABC法染色，二氨基聯(lián)苯胺顯色系統(tǒng)顯色；流水終止反應(yīng)后蘇木

11、素液復(fù)染，鹽酸酒精分化、清水返藍(lán)，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片觀察。5.觀察方法：應(yīng)用MPIAS-500多媒體彩色病理文分析系統(tǒng)對染色陽性細(xì)胞進(jìn)行記數(shù)。6.統(tǒng)計方法：應(yīng)用Systat統(tǒng)計軟件包的方差分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。結(jié)果正常對照組、假手術(shù)組、左側(cè)大腦組織、缺血1 h和4 h組均未見陽性著色細(xì)胞，缺血12 h組右側(cè)額皮質(zhì)及扣帶皮質(zhì)可見淺淡棕黃染色細(xì)胞，缺血24 h組右側(cè)額皮質(zhì)、扣帶皮質(zhì)及尾殼核內(nèi)側(cè)部神經(jīng)元深重染色，到缺血48 h僅右側(cè)扣帶皮質(zhì)中細(xì)胞形態(tài)尚完整的神經(jīng)元有陽性染色；著色部位為神經(jīng)元的胞漿和核膜（1，2）。在缺血的所有時程膠質(zhì)細(xì)胞都無陽性染色，而在神經(jīng)元陽性染色的時程及區(qū)域

12、，血管內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)陽性染色。COX-2染色陽性細(xì)胞記數(shù)可見：缺血12 h陽性細(xì)胞開始增多(46±19） 個/mm2,缺血24 h達(dá)到高峰(70±14） 個/mm2,缺血48 h呈下降趨勢(41±13） 個/mm2，差異有顯著意義（P<0.01）。1缺血24h半暗帶COX-2陽性著色的神經(jīng)元數(shù)量達(dá)高峰。抗COX-2免疫組化染色×4002缺血48h半暗帶區(qū)僅細(xì)胞形態(tài)完整的神經(jīng)元呈出COX-2陽性著色。抗COX-2免疫組化染色×400討論COX-1蛋白本身存在于細(xì)胞內(nèi)，在正常情況下持續(xù)產(chǎn)生大量前列腺素，維持細(xì)胞的基本功能；而COX-2在生理狀況

13、下不存在于細(xì)胞內(nèi)，只有在細(xì)胞受到某些刺激誘導(dǎo)后才形成，其形成過程較為緩慢，Wu等3報道，用白介素-1刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后2 h，COX-2 mRNA開始表達(dá)，68 h后蛋白開始表達(dá)，同時有前列環(huán)素(PGI2)形成，在1824 h蛋白表達(dá)水平達(dá)到最大值。我們發(fā)現(xiàn)，在腦缺血刺激的狀況下，神經(jīng)細(xì)胞COX-2蛋白的表達(dá)同樣遵循這一規(guī)律。腦缺血后COX-2蛋白表達(dá)水平增高的原因：在COX-2基因的啟動子區(qū)存在轉(zhuǎn)錄因子AP1、SP1等結(jié)合序列，可以調(diào)控COX-2基因的轉(zhuǎn)錄速度和水平4。腦缺血的早期即刻早期基因c-fos、c-jun的表達(dá)水平增加，遷移率變動分析發(fā)現(xiàn)，腦缺血時轉(zhuǎn)錄因子AP1（FOS與JUN

14、的復(fù)合物）的DNA結(jié)合活性增高，由此可能增加COX-2蛋白的表達(dá)。據(jù)此有人推測， COX-2基因可能是即刻早期基因（c-fos、c-jun）的效應(yīng)基因。局灶性腦缺血后存在著缺血中心區(qū)及圍繞中心區(qū)的半暗帶，以往的實驗研究結(jié)果證實，大鼠額頂皮質(zhì)上部、扣帶皮質(zhì)及尾殼核內(nèi)側(cè)部由大腦前、大腦中動脈共同供血，缺血早期該區(qū)神經(jīng)元損傷輕微，但隨著缺血時間的延續(xù)，逐漸演變成為壞死區(qū)的一部分，因而被認(rèn)為是“缺血性半暗帶”的組織學(xué)等值區(qū)5。我們觀察到，COX-2蛋白主要由半暗帶的神經(jīng)元表達(dá)，尤其是由細(xì)胞形態(tài)完整的神經(jīng)元表達(dá)，而膠質(zhì)細(xì)胞并不表達(dá)。COX-2蛋白在半暗帶區(qū)延遲表達(dá)的特性說明，該酶并不介入腦缺血的急性損傷

15、反應(yīng)，而可能與缺血半暗帶區(qū)的遲發(fā)性神經(jīng)元死亡有關(guān)。目前，人們對COX-2在細(xì)胞死亡機(jī)制中的作用仍不十分清楚，部分研究者認(rèn)為COX-2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，Tocco等6觀察了注射紅藻酸后大鼠大腦神經(jīng)元COX-2蛋白的表達(dá)和神經(jīng)元凋亡，發(fā)現(xiàn)過度表達(dá)COX-2的神經(jīng)元與具凋亡特征的神經(jīng)細(xì)胞在解剖部位上重疊，在出現(xiàn)時間上一致；對神經(jīng)元作單型細(xì)胞培養(yǎng)，用谷氨酸處理，觀察到COX-2蛋白高度表達(dá)的神經(jīng)元出現(xiàn)凋亡。Nakagomi等7觀察到環(huán)氧酶抑制劑吲哚美辛可抑制沙土鼠海馬神經(jīng)元延遲性損傷。缺血半暗帶區(qū)增高的COX-2蛋白可能利用該區(qū)殘留的氧供，產(chǎn)生大量的細(xì)胞毒性氧自由基，從而對膜磷脂、蛋白和DNA產(chǎn)生損害作用

16、；COX-2能增加前列腺素和血栓烷素的形成，這些產(chǎn)物為一類炎性因子，可促進(jìn)中性粒細(xì)胞的慕聚，釋放蛋白水解酶和自由基，對神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用；COX-2還可能通過對NO通路的調(diào)節(jié)而產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡8。然而，對非神經(jīng)細(xì)胞的研究卻得出相反的觀點，認(rèn)為COX-2可能參與細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制。Tsujii等9發(fā)現(xiàn)，通過遺傳工程技術(shù)過度表達(dá)COX-2 mRNA的大鼠小腸上皮細(xì)胞，出現(xiàn)高水平的BCL-2蛋白表達(dá)，該細(xì)胞對誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的環(huán)境條件具有較高的耐受性。von Knethen等10觀察到COX-2可阻止一氧化氮啟動的細(xì)胞凋亡，其保護(hù)作用可能是通過產(chǎn)生前列腺素類，尤其是前列腺素E2(PGE2

17、)，提高靶細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，從而抑制細(xì)胞凋亡。我們認(rèn)為COX-2在缺血神經(jīng)細(xì)胞損傷機(jī)制中可能發(fā)揮雙向作用，首先COX-2通過花生四烯酸的環(huán)氧酶途徑，產(chǎn)生大量自由基，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡；另一方面，通過增加PGI2、PGE2的產(chǎn)生量，擴(kuò)張小血管，改善局部微循環(huán)，促進(jìn)缺血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的存活，還可能通過提高靶細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，抑制細(xì)胞凋亡。究竟何種情況占優(yōu)勢，可能存在量效關(guān)系，諸如缺血區(qū)微循環(huán)狀況、自由基產(chǎn)生量、前列腺素如何進(jìn)一步代謝(尤其是PGI2和PGE2的水平等），以及各種前列腺素受體在特定狀況和細(xì)胞類型時的表達(dá)水平，尚需進(jìn)一步的實驗研究。作者單位：張在強(qiáng)（北京天壇醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科100050 ）龍

18、潔（北京天壇醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科100050 ）路敦躍（北京天壇醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科100050 ）參考文獻(xiàn)：1Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke, 1989, 20: 84-91.2包新民，舒斯云，著.大鼠腦立體定位譜.北京:人民衛(wèi)生出版社,1991.22-24.3Wu KK, Sanduja R, Tsai AL, et al. Aspirin inhibits interleukin 1-induc

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