大鼠局灶性腦缺血后腦組織環(huán)氧酶-2蛋白的表達

1、    大鼠局灶性腦缺血后腦組織 環(huán)氧酶-2蛋白的表達        摘要：目的觀察大鼠持久性腦缺血不同時相過程中腦組織環(huán)氧酶-2蛋白的表達特性。方法采用線栓法大鼠大腦中動脈阻塞模型，以尾殼核平面為模板，應用免疫組織化學方法觀察假手術組及缺血1、4、12、24和48 h組環(huán)氧酶-2蛋白陽性染色細胞的分布部位及數量。結果 正常對照組、假手術組、缺血1和4 h組均無陽性染色細胞，缺血12 h陽性染色細胞開始增多(46±19） 個/mm2,缺血24 h達到高峰(

2、70±14） 個/mm2，缺血48 h陽性細胞數量減少(41±13） 個/mm2，差異有顯著意義。陽性染色細胞僅見于額頂部大腦皮質上部、扣帶皮質中細胞形態(tài)完整的神經元及血管內皮細胞，而膠質細胞并無著色。結論環(huán)氧酶-2蛋白主要由缺血半暗帶的神經元和血管內皮細胞表達，缺血早期環(huán)氧酶-2蛋白并不表達，表達時間具有延遲性，提示其可能與遲發(fā)性神經元損傷有關。關鍵詞：腦缺血； 前列腺素內過氧化物合酶The expression of cyclooxygenase-2 in focal cerebral ischemia in ratsZHANG ZaiqiangLONG JieLU D

3、unyue（Department of Neurology, Tiantan Hospitol, Beijing 100050， China）Abstract：ObjectiveTo explore the characteristic of the expression of COX-2 protein in different intervals following permanent focal cerebral ischemia in rats. MethodsA model of the middle cerebral artery occlusion (MCAO) in rats

4、was performed with the intraluminal filament occlusion. The rats brains were cut in the coronal planes at the levels of the caudoputamen as the templates.The immunohistochemistry staining was used to facilitate the observation of the distributions and quantities of COX-2 protein in the brain tissues

5、 following the sham operation and the permannent MCAO for 1 h, 4 h,12 h, 24 h and 48 h respectively. ResultsThere were no immunochemistry positive staining among the control group,the sham operation group,and the beginning ischemic group with MCAO for 1 h and 4 h. However, a significant increase in

6、COX-2 immunostaining was detected 12 h after MCAO (46±19)/mm2. It was most marked 24 h (70±14)/mm2, by 48 h after MCAO the positive staining cells gradually decreased (41±13)/mm2. The difference among those groups was significant (P<0.01). The immunochemistry positive staining only

7、 occurred in the neurons and vascular endothelials in the upper frontoparietal cortices and cingulate gyri,whereas the gliocytes did not show positive staining. ConclusionThe induction of COX-2 protein was evident in neurons and vascular endothelials at the ischemic penumbra,and the characteristics

8、of the delayed expression indicated that it might involve in the mechanism of delayed neuronal death.Key words：Cerebral ischemia; Prostaglandin-endoperoxide synthase缺血后磷脂酶A2激活，促進膜磷脂降解，大量形成花生四烯酸，后者在環(huán)氧酶作用下，代謝成為前列腺素和血栓烷素。目前，2種不同的環(huán)氧酶（COX）基因已被確定：COX-1呈結構性表達，而COX-2的表達受炎性刺激和突觸膜激活的誘導。以往的實驗資料表明，腦缺血后腦實質中前列腺素和

9、血栓烷素水平升高，這種增高的效應可被預先應用環(huán)氧酶抑制劑所阻斷；在短暫全腦缺血實驗中發(fā)現，環(huán)氧酶抑制劑可改善缺血神經元損害，這就意味著花生四烯酸環(huán)氧酶途徑代謝產物在缺血神經元中毒機制中具有重要作用。在本研究中，我們用免疫組化方法對大鼠持久性腦缺血不同時相過程中腦組織環(huán)氧酶-2蛋白的表達進行了觀察?，F報道如下。材料和方法1.實驗動物：Wistar雄性大鼠55只，體重250300 g，月齡2.53.0個月，由中國醫(yī)學科學院動物研究所提供。隨機將大鼠分為正常對照組、腦缺血1、4、12、24及48 h組，缺血組各配1個假手術組，每組5只。2.大鼠大腦中動脈阻斷局灶性腦缺血模型：參照Longa等1的線栓

10、法，略有改進，栓線采用直徑0.22 mm尼龍魚線，頭端5 mm膨大(直徑約0.250.28 mm)。栓線從頸外動脈與頸總動脈分叉處進線約20 mm遇阻即止；全部大鼠均栓塞右側大腦中動脈。假手術組栓線進入15 mm,于各時間點斷頭取材。統(tǒng)一采用尾殼核平面腦切片(視神經末端冠切)2作為觀察對象。3抗體：COX-2抗體(山羊抗鼠IgG,Santa Cruz公司)，稀釋度為1100，二抗生物素化兔抗山羊IgG(Santa Cruz公司)，抗體稀釋度為1100。4.免疫組化染色方法：標本組織常規(guī)酒精脫水透明、石蠟包埋，切片5 m 厚，采用免疫組化ABC法染色，二氨基聯(lián)苯胺顯色系統(tǒng)顯色；流水終止反應后蘇木

11、素液復染，鹽酸酒精分化、清水返藍，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片觀察。5.觀察方法：應用MPIAS-500多媒體彩色病理文分析系統(tǒng)對染色陽性細胞進行記數。6.統(tǒng)計方法：應用Systat統(tǒng)計軟件包的方差分析對數據進行處理。結果正常對照組、假手術組、左側大腦組織、缺血1 h和4 h組均未見陽性著色細胞，缺血12 h組右側額皮質及扣帶皮質可見淺淡棕黃染色細胞，缺血24 h組右側額皮質、扣帶皮質及尾殼核內側部神經元深重染色，到缺血48 h僅右側扣帶皮質中細胞形態(tài)尚完整的神經元有陽性染色；著色部位為神經元的胞漿和核膜（1，2）。在缺血的所有時程膠質細胞都無陽性染色，而在神經元陽性染色的時程及區(qū)域

12、，血管內皮細胞出現陽性染色。COX-2染色陽性細胞記數可見：缺血12 h陽性細胞開始增多(46±19） 個/mm2,缺血24 h達到高峰(70±14） 個/mm2,缺血48 h呈下降趨勢(41±13） 個/mm2，差異有顯著意義（P<0.01）。1缺血24h半暗帶COX-2陽性著色的神經元數量達高峰?？笴OX-2免疫組化染色×4002缺血48h半暗帶區(qū)僅細胞形態(tài)完整的神經元呈出COX-2陽性著色?？笴OX-2免疫組化染色×400討論COX-1蛋白本身存在于細胞內，在正常情況下持續(xù)產生大量前列腺素，維持細胞的基本功能；而COX-2在生理狀況

13、下不存在于細胞內，只有在細胞受到某些刺激誘導后才形成，其形成過程較為緩慢，Wu等3報道，用白介素-1刺激人臍靜脈內皮細胞后2 h，COX-2 mRNA開始表達，68 h后蛋白開始表達，同時有前列環(huán)素(PGI2)形成，在1824 h蛋白表達水平達到最大值。我們發(fā)現，在腦缺血刺激的狀況下，神經細胞COX-2蛋白的表達同樣遵循這一規(guī)律。腦缺血后COX-2蛋白表達水平增高的原因：在COX-2基因的啟動子區(qū)存在轉錄因子AP1、SP1等結合序列，可以調控COX-2基因的轉錄速度和水平4。腦缺血的早期即刻早期基因c-fos、c-jun的表達水平增加，遷移率變動分析發(fā)現，腦缺血時轉錄因子AP1（FOS與JUN

14、的復合物）的DNA結合活性增高，由此可能增加COX-2蛋白的表達。據此有人推測， COX-2基因可能是即刻早期基因（c-fos、c-jun）的效應基因。局灶性腦缺血后存在著缺血中心區(qū)及圍繞中心區(qū)的半暗帶，以往的實驗研究結果證實，大鼠額頂皮質上部、扣帶皮質及尾殼核內側部由大腦前、大腦中動脈共同供血，缺血早期該區(qū)神經元損傷輕微，但隨著缺血時間的延續(xù)，逐漸演變成為壞死區(qū)的一部分，因而被認為是“缺血性半暗帶”的組織學等值區(qū)5。我們觀察到，COX-2蛋白主要由半暗帶的神經元表達，尤其是由細胞形態(tài)完整的神經元表達，而膠質細胞并不表達。COX-2蛋白在半暗帶區(qū)延遲表達的特性說明，該酶并不介入腦缺血的急性損傷

15、反應，而可能與缺血半暗帶區(qū)的遲發(fā)性神經元死亡有關。目前，人們對COX-2在細胞死亡機制中的作用仍不十分清楚，部分研究者認為COX-2誘導細胞凋亡，Tocco等6觀察了注射紅藻酸后大鼠大腦神經元COX-2蛋白的表達和神經元凋亡，發(fā)現過度表達COX-2的神經元與具凋亡特征的神經細胞在解剖部位上重疊，在出現時間上一致；對神經元作單型細胞培養(yǎng)，用谷氨酸處理，觀察到COX-2蛋白高度表達的神經元出現凋亡。Nakagomi等7觀察到環(huán)氧酶抑制劑吲哚美辛可抑制沙土鼠海馬神經元延遲性損傷。缺血半暗帶區(qū)增高的COX-2蛋白可能利用該區(qū)殘留的氧供，產生大量的細胞毒性氧自由基，從而對膜磷脂、蛋白和DNA產生損害作用

16、；COX-2能增加前列腺素和血栓烷素的形成，這些產物為一類炎性因子，可促進中性粒細胞的慕聚，釋放蛋白水解酶和自由基，對神經細胞產生損傷作用；COX-2還可能通過對NO通路的調節(jié)而產生氧化應激反應,誘導細胞凋亡8。然而，對非神經細胞的研究卻得出相反的觀點，認為COX-2可能參與細胞損傷的保護機制。Tsujii等9發(fā)現，通過遺傳工程技術過度表達COX-2 mRNA的大鼠小腸上皮細胞，出現高水平的BCL-2蛋白表達，該細胞對誘導細胞凋亡的環(huán)境條件具有較高的耐受性。von Knethen等10觀察到COX-2可阻止一氧化氮啟動的細胞凋亡，其保護作用可能是通過產生前列腺素類，尤其是前列腺素E2(PGE2

17、)，提高靶細胞內cAMP水平，從而抑制細胞凋亡。我們認為COX-2在缺血神經細胞損傷機制中可能發(fā)揮雙向作用，首先COX-2通過花生四烯酸的環(huán)氧酶途徑，產生大量自由基，誘導神經細胞凋亡；另一方面，通過增加PGI2、PGE2的產生量，擴張小血管，改善局部微循環(huán)，促進缺血區(qū)神經細胞的存活，還可能通過提高靶細胞內cAMP水平，抑制細胞凋亡。究竟何種情況占優(yōu)勢，可能存在量效關系，諸如缺血區(qū)微循環(huán)狀況、自由基產生量、前列腺素如何進一步代謝(尤其是PGI2和PGE2的水平等），以及各種前列腺素受體在特定狀況和細胞類型時的表達水平，尚需進一步的實驗研究。作者單位：張在強（北京天壇醫(yī)院神經內科100050 ）龍

18、潔（北京天壇醫(yī)院神經內科100050 ）路敦躍（北京天壇醫(yī)院神經內科100050 ）參考文獻：1Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke, 1989, 20: 84-91.2包新民，舒斯云，著.大鼠腦立體定位譜.北京:人民衛(wèi)生出版社,1991.22-24.3Wu KK, Sanduja R, Tsai AL, et al. Aspirin inhibits interleukin 1-induc

19、ed prostaglandin H synthase expression in cultured endothelial cells.Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88: 2384-2387.4Kosaka T, Miyata A,Ihara H,et al.Characterization of the human gene (PTGS2) encoding prostaglandin-endoperoxide synthase 2.Eur J Biochem,1994,221:889-897.5Dereski MO, Chopp M,Knighht RA,et al.The heterogeneous temporal evolution of focal ischemic neuronal damage in the rat.Acta Neuropathol(Berl),1993,85:327-333.6Tocco G,Freire-Moar J,Schreiber SS,et al.Maturational regulation and regional induction of cyclooxygenase-2 in rat brain: implications fo