橫紋肌肉瘤p16基因及其蛋白表達(dá)的研究

1、    橫紋肌肉瘤p16基因及其蛋白表達(dá)的研究            關(guān)鍵詞：橫紋肌肉瘤；基因；抑制；腫瘤    New Page 1 【摘要】 目的 探討p16基因及其蛋白表達(dá)與橫紋肌肉瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。方法 應(yīng)用PCR-SSCP分析及免疫組化方法檢測(cè)了44例人橫紋肌肉瘤(RMS)中p16基因狀態(tài)和47例RMS中p16蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 2例有p16基因純合性缺失,6例突變。p16基因異常的8例

2、RMS中6例伴廣泛浸潤(rùn)、復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。p16蛋白表達(dá)陰性率為38.3%(18/47例)。p16基因異常的8例中有7例p16蛋白陰性,1例為陽(yáng)性。另有11例p16蛋白陰性而未查見(jiàn)基因異常。在腺泡狀橫紋肌肉瘤中，p16基因異常發(fā)生率及p16蛋白表達(dá)缺失率均高于胚胎性橫紋肌肉瘤。p16蛋白陰性的RMS更易伴發(fā)廣泛浸潤(rùn)、復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。結(jié)論 p16基因異常及p16蛋白表達(dá)缺失可能與部分橫紋肌肉瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。    A study of p16 gene and its protein expression in rhabdomyosarcoma Gao Zhian

3、, Zhang Shiyu, Yang Guanghua. Department of Pathology, First Medical School, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041    【Abstract】 Objective To evaluate the relationship between alteration of p16 gene, its protein expression and the pathogenesis and development

4、of rhabdomyosarcoma (RMS).Methods 44 cases of RMS were examined for alteration of p16 gene with PCR-SSCP and 47 cases of RMS were examined for p16 protein expression with immunohistochemical method. Results The homozygous deletion of p16 gene was observed in 2 cases and mutations in 6 cases.Of these

5、 8 cases with altered p16 gene, 6 had extensive invasion, recurrence or metastasis. The total negative rate of p16 protein expression in RMS was 38.3% (18/47 cases). Of these 8 cases with alterations of p16 gene, negative expression for p16 protein was observed in 7 cases and positive in only 1 case

6、s. In contrast, no structural abnormalities of the p16 gene were detected in another 11 cases with negative expression of p16 protein. Higher rates of p16 gene abnormality and loss of p16 protein were observed in ARMS than in ERMS. Higher rate of extensive invasion, recurrence or metastasis was also

7、 found in the group negative for p16 protein. Conclusion The abnormalities of p16 gene and loss of p16 protein expression may be related to the pathogenesis and development of some RMS.    【Key words】 Rhabdomyosarcoma Genes, Suppressor, tumor    橫紋肌肉瘤(rhabdomy

8、osarcoma,RMS)是惡性程度甚高的常見(jiàn)軟組織肉瘤，好發(fā)于兒童及青少年。有關(guān)RMS的分子遺傳學(xué)異常如染色體異位、N-myc原癌基因擴(kuò)增及p53基因突變等已有報(bào)道1，2。p16基因是新近鑒定的腫瘤抑制基因，在許多類型腫瘤細(xì)胞株及腫瘤中發(fā)生缺失或突變3。我們應(yīng)用PCR-SSCP方法觀察RMS中p16基因的狀態(tài)，并應(yīng)用免疫組化方法觀察p16蛋白的表達(dá)，旨在探索p16基因及其蛋白表達(dá)異常在RMS發(fā)生發(fā)展中的作用及其臨床意義。    材料與方法    1.標(biāo)本：47例RMS&127;標(biāo)本取自華西醫(yī)科大學(xué)附屬第一

9、臨床醫(yī)院病理科及眼科19721996年存檔蠟塊。全部病例經(jīng)復(fù)查并經(jīng)免疫組化證實(shí)為診斷確切的RMS，其中胚胎性(ERMS)28例，腺泡狀(ARMS)16例，多形性(PRMS)3例。14例伴局部廣泛浸潤(rùn)、復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。    2.免疫組化染色：采用SP免疫組化法。兔抗人p16蛋白(SC-468)多克隆抗體為美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品，工作濃度為1100。對(duì)照：以皮內(nèi)痣組織為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替第一抗體為陰性對(duì)照。    結(jié)果判定：以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒定為陽(yáng)性。結(jié)果分別記錄為：(-)：無(wú)明顯陽(yáng)性細(xì)胞；(+)：陽(yáng)性

10、細(xì)胞<40%；(+)：陽(yáng)性細(xì)胞>40%。    3.PCR-SSCP分析：應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增p16基因第1、2外顯子，GAPDH基因片段引物作為PCR對(duì)照，引物序列見(jiàn)文獻(xiàn)4。PCR反應(yīng)在PE 480 DNA熱循環(huán)儀上進(jìn)行。反應(yīng)總體積為20 1，擴(kuò)增產(chǎn)物行6%非變性聚丙烯酰胺凝膠(含10%甘油)電泳，凝膠用硝酸銀或EB染色后，觀察結(jié)果。    4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用卡方檢驗(yàn)。    結(jié)果    1.免疫組化結(jié)果：47例RMS中，

11、p16蛋白陽(yáng)性29例(61.7%)，陰性18例(38.3%)，見(jiàn)13。p16蛋白陽(yáng)性率在28例ERMS中為75.0%，而在16例ARMS中為43.8%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P<0.05差異有顯著性。在p16蛋白陽(yáng)性組，腫瘤廣泛浸潤(rùn)、復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的發(fā)生率為17.2%(5/29例)。而在p16蛋白陰性組則為50.0%(9/18例)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P<0.05，差異有顯著性。p16蛋白陽(yáng)性29例中，ERMS 21例，ARMS 7例，PRMS 1例，廣泛浸潤(rùn)，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移5例。p16蛋白陰性18例中，ERMS 7例，ARMS 9例，PRMS 2例，廣泛浸潤(rùn)、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移9例。  &

12、#160; 2.PCR-SSCP分析結(jié)果：47例RMS中，有3例p16基因第1、2外顯子和GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物均缺如，故認(rèn)為是因標(biāo)本DNA破壞致不能擴(kuò)增。其余44例中2例(4.5%)有p16基因缺失，均為ARMS。SSCP分析結(jié)果顯示6例基因突變，均發(fā)生于第2外顯子，其中ERMS和ARMS各3例(4，5)。在突變的1例轉(zhuǎn)移和1例復(fù)發(fā)的腫瘤中，對(duì)原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶，復(fù)發(fā)前后病灶分別進(jìn)行SSCP分析，結(jié)果原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶，復(fù)發(fā)前后病灶基因改變相同。在p16基因異常的8例中。有6例發(fā)生廣泛浸潤(rùn)、復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，而p16基因無(wú)異常的36例中為8例(22.2%)。p16基因異常與RMS亞型及廣泛浸潤(rùn)、復(fù)發(fā)

13、或轉(zhuǎn)移的關(guān)系見(jiàn)附表。    M：Marker pBR322/Hae DNA標(biāo)準(zhǔn)，1：正常對(duì)照，2，3，5，6：ERMS，8：ARMS，9：PRMS，均顯示242 bp和450bp兩條產(chǎn)物帶，4，7：ARMS，242 bp p16基因產(chǎn)物缺如，而450 bpGAPDH產(chǎn)物存在    4 p16基因外顯子2a產(chǎn)物電泳結(jié)果(銀染)    M：Marker pBR322/Hae DNA標(biāo)準(zhǔn)，1：正常對(duì)照，2：ERMS，SSCP陽(yáng)性，3：ARMS，SSCP陽(yáng)性(原發(fā)灶)，4：ARMS，

14、5：ERMS，SSCP陽(yáng)性(p16蛋白陽(yáng)性)，6：與3為同一病例，轉(zhuǎn)移灶SSCP陽(yáng)性，7：ARMS    5 p16基因外顯子2b SSCP電泳結(jié)果(EB染色)    1 ERMS，示小圓形和星形原始間葉樣腫瘤細(xì)胞，間質(zhì)粘液變 HE×200 2 ERMS，Myoglobin染色，示胞漿陽(yáng)性 SP法×200 3 ERMS，p16蛋白染色，胞核呈陽(yáng)性 SP法×300附表 p16基因異常與RMS亞型及廣泛    浸潤(rùn)、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的關(guān)系(例數(shù)) 

15、;   p16基因    ERMS    ARMS    PRMS    廣泛浸潤(rùn)    復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移    (-)    (+)    無(wú)異常    23    11&#

16、160;   2    28    8    缺失    0    2    0    0    2    突變    3    

17、3    0    2    4    在p16基因異常的8例RMS中，7例p16蛋白表達(dá)陰性；1例基因突變，但p16蛋白陽(yáng)性，另有11例p16蛋白陰性，但未查見(jiàn)基因異常。p16基因異常與p16蛋白表達(dá)的關(guān)系：p16蛋白(-)中：p16基因無(wú)改變11例，缺失2例，突變5例。p16蛋白(+)中P16基因無(wú)改變25例，缺失無(wú)，突變1例。    討論    p16

18、基因定位于9號(hào)染色體短臂21區(qū)(9P21)，整個(gè)基因由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，126 bp的外顯子1和307bp的外顯子2構(gòu)成了該基因的97%編碼區(qū)，其編碼產(chǎn)物p16蛋白直接參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)，是細(xì)胞G1期重要的負(fù)調(diào)節(jié)蛋白5。我們應(yīng)用PCR-SSCP及免疫組化方法分別檢測(cè)了44例和47例RMS中p16基因狀態(tài)及p16蛋白的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)44例中2例有p16基因純合性缺失，6例有基因突變；47例RMS中p16蛋白表達(dá)缺失率為38.3%(18/47例)。這些結(jié)果提示p16基因異常和p16蛋白表達(dá)缺失可能與部分RMS的發(fā)生有關(guān)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道4，5p16基因缺失在腫瘤細(xì)胞株發(fā)生率相當(dāng)高，而在實(shí)體腫瘤相

19、對(duì)低得多。對(duì)于這種差異有幾種解釋：一是認(rèn)為基因缺失賦予細(xì)胞選擇性生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，使其在培養(yǎng)基中容易存活，因而基因異常檢出率高；另一種是在實(shí)體腫瘤中非腫瘤細(xì)胞存在是不可避免的，這些非腫瘤細(xì)胞DNA的污染可能造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差；然而另一因素也可能存在，即在體外培養(yǎng)條件下，細(xì)胞傳代過(guò)程中會(huì)增加基因異常的機(jī)會(huì)。    在p16基因異常的8例RMS中，7例p16蛋白表達(dá)陰性，說(shuō)明基因異常導(dǎo)致蛋白表達(dá)缺失。而1例SSCP分析發(fā)現(xiàn)基因突變，但p16蛋白表達(dá)陽(yáng)性，提示p16基因雖發(fā)生堿基改變，但未影響其編碼蛋白質(zhì)的功能，可能是一種基因多態(tài)性。在p16蛋白表達(dá)陰性的18例RMS

20、中，有11例未查見(jiàn)p16基因異常。在這些病例中p16蛋白表達(dá)缺失也可能是由于p16基因失活所致，但其失活機(jī)制應(yīng)用我們的檢測(cè)方法尚不能發(fā)現(xiàn)。最近有報(bào)道指出，DNA異常甲基化可能與p16基因失活有關(guān)6。p16蛋白是周期素依賴激酶抑制因子(cyclindependent kinase inhibitors,CKI)家族的重要成員。在體內(nèi)p16蛋白與cyclinD1蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CDK4和CDK6，并抑制其催化Rb蛋白磷酸化的活性，進(jìn)而阻止細(xì)胞周期進(jìn)展。當(dāng)p16蛋白因基因失活而表達(dá)缺失時(shí)，失去了對(duì)CDK4和CDK6的抑制作用，CDK4和CDK6與cyclinD1蛋白結(jié)合而活化，促使Rb蛋白磷酸化而失活，

21、導(dǎo)致細(xì)胞失控性增殖而有利于腫瘤形成。    分析不同亞型RMS中p16基因異常和p16蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，在16例ARMS中有5例(31.3%)p16基因異常，而在26例ERMS中僅為3例(11.5%)。再者p16蛋白表達(dá)陽(yáng)性率在ARMS也明顯低于ERMS。這可能提示在ARMS中更容易發(fā)生p16基因及其蛋白表達(dá)異常，同時(shí)也可能反映出p16基因異常及p16蛋白表達(dá)缺失與ARMS的臨床生物學(xué)行為惡性度較高有關(guān)，并可能為預(yù)示RMS患者預(yù)后提供幫助。    我們也分析了伴局部廣泛浸潤(rùn)、復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的RMS中p16基因及其蛋白表達(dá)的

22、情況，發(fā)現(xiàn)p16基因異常的8例中有6例發(fā)生腫瘤廣泛浸潤(rùn)、復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，而在p16基因無(wú)異常的36例中僅8例(22.2%)。在p16蛋白陰性組，腫瘤廣泛浸潤(rùn)、復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的發(fā)生率明顯高于p16蛋白陽(yáng)性組。與文獻(xiàn)報(bào)道一致7，8，提示p16基因異常及p16蛋白表達(dá)缺失與RMS惡性進(jìn)展有關(guān)。在我們的研究中有絕大部分RMS未查見(jiàn)p16基因結(jié)構(gòu)異常，也有半數(shù)以上的病例p16蛋白表達(dá)呈陽(yáng)性，在這部分病例中有其它基因參與其發(fā)病的可能性是較大的。    參考文獻(xiàn)    1Dias P,Kumar P,Marden HB,et al.N-

23、myc gene is amplifed in alveolar rhabdomyosarcoma (RMS)but not in embryonal RMS.Int J Cancer，1990，45:593-596.    2Filix CA, Chavez Kappel C,Mitsudomi T, et al. Frequency and diversity of p53 mutations in childhood rhabdomyosarcoma.Cancer Res，1992，52:2243-2247.    3Nobori T,Miura K,WU DJ,et al. Deletion of the cyclin-dependent kinasey-4 inhibitor gene in multiple human cancers. Nature，1994，368:753-756.    4Zhang SY, Klein-Szant AJP, Sauter ER, et al. Higher frequency of alteration in the p16/CDKN2 gene in squamous cell carcinoma