環(huán)氧合酶-2和ki-67在宮頸鱗狀細胞癌組織中的表達

1、環(huán)氧合酶-2和ki-67在宮頸鱗狀細胞癌組織中的表達    【摘要】  目的 研究環(huán)氧合酶-2(COX-2)和ki-67在慢性宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤樣變(CIN)、宮頸鱗狀細胞癌(SCC)中的表達及其相關性。方法 RT-PCR法檢測COX-2 mRNA在正常、炎性、CIN組織和SCC組織中的表達；免疫組化法檢測各組中COX-2和ki-67蛋白的表達。結(jié)果 COX-2 mRNA和蛋白在正常組無表達，在炎性、CIN和SCC組表達升高(P<0.05)，COX-2蛋白的表達與腫瘤體積和浸潤

2、深度有關(P<0.05)。ki-67在正常組中偶有表達，在炎性組和CIN組表達增高，在SCC組顯著增高(P<0.01)()。COX-2與ki-67蛋白的表達相關(r=0.675，P<0.001)。結(jié)論 COX-2表達增高可能是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的早期事件，與細胞異常增生有關。   【關鍵詞】  環(huán)氧合酶-2；Ki-67；宮頸癌；細胞增殖If they say you are good, ask yourself if it be ture.  ABSTRACT: Objective  To&

3、#160;study the expression of cyclooxygenase (COX-2) and ki-67 in chronic cervicitis, cervical intraepithelial neoplasia (CIN), squamous carcinoma of the cervix(SCC)and their relationship. Me

4、thods  Tissue samples were harvested respectively from normal, inflammational, CIN and 30 SCC tissues. The expression of COX-2 mRNA was detected by RT-PCR method. COX-2 a

5、nd ki-67 proteins were detected by inmmunohistochemical method. Results  The overall expression of COX-2 mRNA and protein was higher in inflammation, CIN and SCC groups t

6、han that in normal cervix (P<0.05). COX-2 protein expression was correlated with tumor size and invasion depth (P<0.05). Ki-67 protein was higher in the other groups

7、0;than that in normal cervix (P<0.05). Ki-67 was expressed in SCC group at a high level, which significantly differed from the expression in inflammation group (P<0.01).

8、 A significant correlation was found between COX-2 and ki-67 protein (r=0.675, P<0.001). Conclusion  COX-2 may be an early incident of squamous cervical carcinogenesis rela

9、ted to cell proliferation.KEY WORDS:  cyclooxygenase-2; ki-67; cervical carcinoma; cell proliferationDeeds are fruits; words are but leaves.      環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)是炎癥反應中催化前列腺素合成的一個限速酶。有研究發(fā)現(xiàn)COX-2在結(jié)腸癌、食管

10、癌、宮頸癌中表達升高，其表達同免疫抑制、血管生成、抗凋亡和細胞增殖有關，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展1-3。ki-67抗原為細胞分裂增殖相關蛋白，可識別生長中的細胞，評估細胞增生4。本研究通過檢測COX-2和ki-67在宮頸正常組織、慢性宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤樣變(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)、宮頸鱗狀細胞癌(squamous carcinoma of the cervix, SCC)中的表達，探討COX-2在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用和機制。Wine and judgement

11、 mature with age.  1  材料與方法A man cannot whistle and drink at he same time.  1.1  標本來源與分組   實驗分2組，實驗組均取自西安交通大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院2005年11月至2006年3月手術切除并經(jīng)病理學證實的標本(醫(yī)藥學/臨床醫(yī)學論文 )。其中宮頸癌組30例，患者年齡32-72歲，平均(44.23±8.85)歲；對照組包括，慢性宮頸炎10例，患者年齡29-43歲，平均(30.58±10.25)歲；CIN 

12、;10例，患者年齡37-50歲，平均(46.50±3.94)歲；正常宮頸10例，患者年齡29-43歲，平均(37.52±6.84)歲。所有病例術前2 周內(nèi)均未服用消炎痛、阿斯匹林等影響前列腺素代謝的藥物。采得的新鮮組織2份，1份液氮處理后，-80 冰箱凍存以備RT-PCR檢測，另1份4%(體積分數(shù))甲醛溶液固定，石蠟包埋，以備免疫組化染色。1.2  RT-PCR法及結(jié)果判定 The farmers are the founders of civilization and prosperity.  -actin(30

13、3 bp)用于內(nèi)對照，PBS液代替引物作為陰性對照。總RNA提取后，紫外分光光度計(美國Nano Drop ND-100 Spectrophotometer儀)檢測RNA純度(>1.6)，計算出RNA濃度，取2 g進行RT-PCR。引物設置：COX-2(530 bp)上游引物：AAGCCTTCTCTAACCTCTCC；下游引物：TAAGCACATCGCATACTCTG；-Actin(303 bp)上游引物：AGCGGGAAATTGTGCATG；下游引物：CAGGGTACCTGGTGGTGCC(由陜西理生醫(yī)療科技有限公司

14、合成)。在同一反應體系，按照RT-PCR酶混合物試劑(陜西理生醫(yī)療科技有限公司)說明結(jié)合參考文獻5提供的逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)及參數(shù)進行RT-PCR：37 反應30 min，95  3 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶后95 變性30 s，57.4 退火30 s，72 延伸30 s，反應30個循環(huán)。取擴增產(chǎn)物進行0.5 mg/L瓊脂糖電泳，溴化乙錠染色，紫外燈下觀察結(jié)果。用凝膠成像系統(tǒng)進行半定量分析(美國Bio-Rad凝膠成像分析儀，型號：Gel Doc EQ)，取目的基因條帶和-

15、actin條帶強度的比值作為目的基因的相對值。He that runs fastest gets the ring.  1.3  免疫組化染色及結(jié)果判定   常規(guī)切片(4 m)，脫蠟，檸檬酸沸水修復抗原，其余步驟按SP免疫試劑盒(北京中山試劑公司產(chǎn)品)說明操作?？笴OX-2多克隆抗體、抗ki-67單克隆抗體購自北京中山試劑公司，工作濃度分別為11 200，1200。用已知膀胱癌陽性片作陽性對照，PBS液代替一抗作陰性對照。結(jié)果判斷：COX-2陽性染色主要為胞質(zhì)，少數(shù)為核膜著色。ki-67陽性染色主要為胞核和核膜著色。免疫組織

16、化學標本經(jīng)Image-proplus圖像分析軟件進行圖像分析6，每個標本隨機選取3個高倍視野，測定單位面積下平均灰度值，最后求每張切片的平均灰度值及標準差。本次測量灰度值標準，極白為255，極黑為0，共256階。故染色越淺，灰度值越大；染色越深，灰度值越小，考慮背景色的誤差，將灰度值200者視為陰性。It is a small flock that has not a black.  1.4  統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件處理。多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，兩組間均數(shù)比較根據(jù)方差是否齊性采用t或t檢驗，等級資料

17、采用Spearman相關系數(shù)分析，兩組計量資料之間的關系采用Pearson相關系數(shù)分析，P<0.05為有統(tǒng)計學意義。2  結(jié) 果  2.1  COX-2 mRNA和蛋白的表達 COX-2蛋白在正常組無表達，炎性、CIN組、SCC組表達依次升高，與正常組比較具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，但病變各組間無統(tǒng)計學差異(P>0.05，表1)。宮頸病變各組COX-2蛋白表達陽性率增高。COX-2 mRNA在正常組不表達，宮頸病變各組表達升高(圖1)，但與蛋白表達不完全一致(r=0.135，P=0.

18、68)。表1  COX-2在不同的宮頸組織中的表達（略）2.2  ki-67蛋白在宮頸組織中的表達 ki-67在正常宮頸組偶有表達，炎性、CIN和SCC組中表達依次升高，與正常組比較具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，炎性組同SCC組比較具有統(tǒng)計學差異(P<0.01，表2)。宮頸病變各組ki-67蛋白表達陽性率增高，COX-2在CIN和SCC組表達陽性率高于ki-67。 論文教育信息網(wǎng)  Politeness costs nothing and gains everything.  2.3 

19、60;COX-2和ki-67蛋白表達范圍及其與臨床病理特征的關系 Wine and judgement mature with age.  炎性和CIN組中，ki-67主要分布在宮頸的副基底層細胞(parabasal squamous cells)(圖2、3)，SCC組中ki-67表達于腫瘤細胞和血管內(nèi)皮細胞(圖4、5)。COX-2表達范圍較ki-67廣泛。CIN組COX-2除表達于副基底層異常的細胞外，病灶周圍正常細胞及炎性細胞也有表達，偶見于新生血管內(nèi)皮細胞，其表達隨著與病灶距離的增加而減弱(圖2、3)；SCC組COX-2除表達于腫瘤細胞外，癌灶周圍

20、的炎性細胞及血管內(nèi)皮細胞也有表達(圖4、5)。COX-2蛋白表達與腫瘤的體積和浸潤深度有關(P=0.04，P=0.02)，ki-67表達與任何病理特征均無關(表3)。宮頸病變各組ki-67和COX-2的蛋白表達存在顯著直線相關(r=0.675，P<0.001，圖6)。表2  ki-67蛋白在宮頸組織中的表達（略）表3  COX-2和ki-67蛋白在SCC組中的表達（略）Curiosity killed the cat.  3  討 論    持續(xù)性人乳頭瘤病毒(huma

21、n papilloma virus, HPV)感染是CIN或?qū)m頸癌發(fā)生的一個重要驅(qū)動力4。HPV清除與細胞介導免疫高度相關7。Huan等8比較宮頸癌癌灶和癌周組織的細胞因子，發(fā)現(xiàn)白介素-10(interleukin-10, IL-10)在腫瘤組織中的表達增強，后者與體液介導免疫有關。在慢性炎癥過程中，機體的免疫反應由細胞介導免疫轉(zhuǎn)化為體液介導免疫，COX-2在這一過程中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)COX-2與人類腫瘤關系密切，其作用機制可能與免疫抑制和細胞增殖有關。ki-67是一個細胞增殖的重要分子標記物。宮頸上皮中，ki-67陽性細胞核的分布范圍，可以將CI

22、N病變等級準確分類4。The sea refuses no river.      John9研究在CIN病灶周圍的正常細胞，輕度、中度、重度病變細胞中COX-2的表達陽性率，分別為10%、28%、37%、67%，病灶切緣COX-2的表達還可作為一個監(jiān)測CIN預后的獨立指標(相對危險度=0.68)。John考慮到COX-2染色超過病灶組織平均約1.6 mm，故宮頸環(huán)狀電切術(loop electrosurgical excision procedure, LEEP)切除的組織應超過CIN病灶2&

23、#160;mm以防止復發(fā)。這一研究提示COX-2表達陽性的細胞，即使組織學形態(tài)仍然正常，其生物學行為已經(jīng)發(fā)生改變，易于發(fā)展為CIN。本實驗中，CIN組，COX-2在病變細胞及其周圍正常細胞均有表達，其表達范圍隨著與病灶距離的增加而減弱；SCC組COX-2蛋白的表達與腫瘤體積和浸潤深度相關(P=0.04，P=0.02)。提示COX-2可能參與宮頸癌病變的發(fā)生發(fā)展。    Kim等3發(fā)現(xiàn)宮頸癌中COX-2表達增高的組，其ki-67表達陽性率也增高，故認為COX-2表達與ki-67相關。Ferrandina等10應用COX-2抑制劑治療宮頸癌，發(fā)現(xiàn)其可以抑制癌

24、細胞增殖，使ki-67表達降低。本實驗中，COX-2與ki-67表達存在顯著正相關(r=0.675，P<0.001)。ki-67與COX-2蛋白表達范圍不同，在CIN和SCC組中，ki-67僅在病灶中表達，COX-2在病灶及其周圍組織均表達，其表達陽性率高于ki-67。結(jié)果提示：COX-2表達增高是較ki-67更早的細胞生物學行為。不同于ki-67僅表達于病變組織，COX-2在CIN病灶周圍正常組織中表達增高，使細胞生物學行為改變，調(diào)節(jié)宮頸組織局部免疫，促進細胞增殖，產(chǎn)生一個更利于細胞惡變的微環(huán)境，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展和預后。    COX-2促進細

25、胞增殖的確切機制尚不十分清楚，可能與其主要產(chǎn)物PGE2有關。Quality is better than quantity.      Dai等5發(fā)現(xiàn)COX-2 mRNA和蛋白在宮頸病變各組的表達升高，mRNA表達陽性率高于蛋白，認為COX-2可能存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。Debnath等11研究宮頸癌細胞株紫外線照射下不同時段COX-2的表達，認為射線刺激COX-2 mRNA表達量增高，而mRNA穩(wěn)定因子CUGBP2表達也升高，COX-2蛋白表達被抑制，其量沒有明顯改變。本實驗中，COX-2 mRNA和蛋白在宮頸病變各組表

26、達均升高，但兩者表達不完全一致(r=0.135，P=0.68)。這種差異是否與這一穩(wěn)定因子有關尚待進一步研究。    COX-2蛋白表達增高可能是細胞生物學行為改變的早期事件。COX-2通過調(diào)節(jié)宮頸局部免疫，影響細胞增殖，促進一個更利于細胞惡變的環(huán)境產(chǎn)生，促使宮頸由慢性宮頸炎向CIN和SCC轉(zhuǎn)變。COX-2在宮頸癌早期發(fā)生階段起著重要作用，這為預防宮頸癌提供了新的思路?！緟⒖嘉墨I】  1Sato T, Yoshinaga K, Okabe S, et al.

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28、cell proliferation are increased in MUC2-positzve area of columnar-lined esophagus J. Pathol Intern, 2005, 55(5):546-549.3Kim YB, Kim GE, Pyo HR, et al. Differential cyclooxygenase-2

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