熒光分光光度法測定多維葡萄糖粉中維生素B2的含量

1、熒光分光光度法測定多維葡萄糖粉中維生素B 2的含量一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1. 學(xué)習(xí)熒光分光光度法測定多維葡萄糖粉中維生素B 2的分析原理；2. 掌握熒光分光光度計(jì)的操作技術(shù)和測定多維葡萄糖粉中維生素B 2的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理:1. 維生素B 2（又叫核黃素，VB 2）是橘黃色無臭的針狀結(jié)晶，OHHOHOHO H H 3C N H H H H N H 3C N O 其結(jié)構(gòu)式為：維生素B 2易溶于水而不溶于乙醚等有機(jī)溶劑，在中性或酸性溶液中穩(wěn)定，光照易分解，對熱穩(wěn)定。維生素B 2溶液在430440 nm 藍(lán)光的照射下，發(fā)出綠色熒光，熒光峰在535 nm 。維生素B 2在pH=67的溶液中熒光強(qiáng)度最大，在p

2、H=11的堿性溶液中熒光消失，所以可以用熒光光度法測維生素B 2的含量。葡萄糖中含有維生素B 1、B 2、C 、D 2及葡萄糖，其中維生素C和葡萄糖在水溶液中不發(fā)熒光，維生素B 1本身無熒光，在堿性溶液中用鐵氰化鉀氧化后才產(chǎn)生熒光，維生素D 2用二氯乙酸處理后才有熒光，他們都不干擾維生素B 2的測定。維生素B 2在堿性溶液中經(jīng)光線照射會發(fā)生分解而轉(zhuǎn)化為光黃素，光黃素的熒光比核黃素的熒光強(qiáng)的多，故測維生素B 2的熒光時(shí)溶液要控制在酸性范圍內(nèi)，且在避光條件下進(jìn)行。2. 熒光分光光度計(jì)(1常溫下，處于基態(tài)的分子吸收一定的紫外可見光的輻射能成為激發(fā)態(tài)分子，激發(fā)態(tài)分子通過無輻射躍遷至第一激發(fā)態(tài)的最低振動

3、能級，再以輻射躍遷的形式回到基態(tài)，發(fā)出比吸收光波長長的光而產(chǎn)生熒光。在稀溶液中，熒光強(qiáng)度IF 與物質(zhì)的濃度c 有以下的關(guān)系：I F =2. 303I 0bc當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件一定時(shí)，熒光強(qiáng)度IF 與熒光物質(zhì)的濃度成線性關(guān)系： I F =Kc(2熒光分析法的特點(diǎn):a. 與紫外-可見分光度法比較，熒光分析法具有更高的靈敏度。b. 選擇性好。熒光法既能依據(jù)發(fā)射光譜，又能依據(jù)吸收光譜來這是熒光光譜法定量分析的理論依據(jù)。鑒定物質(zhì)。c. 所需試樣量少、操作方法簡便。(3熒光分析儀器a. 常用的熒光分析儀器由激發(fā)光源、單色器、液槽、檢測器和顯示記錄器五部分構(gòu)成，如下圖所示： b. 熒光分析儀器與分光光度計(jì)比較主要差

4、別有兩點(diǎn)：(a熒光分析儀器采用垂直測量方式，以消除透射光的影響； (b熒光分析儀器有兩個(gè)單色器，能夠獲得單色性較好的激發(fā)光并消除其它雜散光干擾。c. 熒光分光光度計(jì)工作原理：由光源氙弧燈發(fā)出的光通過切光器使其變成斷續(xù)之光以及激發(fā)光單色器變成單色光后，此光即為熒光物質(zhì)的激發(fā)光，被測的熒光物質(zhì)在激發(fā)光照射下所發(fā)出的熒光，經(jīng)過單色器變成單色熒光后照射于測樣品用的光電倍增管上，由其所發(fā)生的光電流經(jīng)過放大器放大輸至記錄儀，激發(fā)光單色器和熒光單色器的光柵均由電動機(jī)帶動的凸輪所控制，當(dāng)測繪熒光發(fā)射光譜時(shí)，將激發(fā)光單色器的光柵，固定在最適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光波長處，而讓熒光單色器凸輪轉(zhuǎn)動，將各波長的熒光強(qiáng)度訊號輸出至記

5、錄儀上，所記錄的光譜即發(fā)射光譜，簡稱熒光光譜。當(dāng)測繪熒光激發(fā)光譜時(shí)，將熒光單色器的光柵固定在最適當(dāng)?shù)臒晒獠ㄩL處，只讓激發(fā)光單色口的凸輪轉(zhuǎn)動，將各波長的激發(fā)光的強(qiáng)度訊號輸出至記錄儀，所記錄的光譜即激發(fā)光譜。當(dāng)進(jìn)行樣品溶液的定量分析時(shí)，將激發(fā)光單色器固定在所選擇的激發(fā)光波長處，將熒光單色器調(diào)節(jié)至所選擇的熒光波長處，由記錄儀得出的信號是樣品溶液的熒光強(qiáng)度。三、試劑與儀器 :970CRT 熒光光度計(jì)5 ml吸量管2只，50 ml容量瓶7只, 100 ml容量瓶1只； 10.0g/ml維生素B 2標(biāo)準(zhǔn)溶液，冰乙酸， 多維葡萄糖粉試樣。四、實(shí)驗(yàn)步驟:（一）970CRT 熒光光度計(jì)基本操作：1. 打開氙燈，

6、再打開主機(jī)，然后打開計(jì)算機(jī)啟動工作站并初始化儀器，預(yù)熱30min 。2. 儀器初始化完畢后，在工作界面上選擇測量項(xiàng)目，設(shè)置適當(dāng)?shù)膬x器參數(shù)：設(shè)置激發(fā)波長為440nm ，發(fā)射波長為540 nm ，靈敏度2，入射縫寬和出射縫寬均為10nm 。3. 點(diǎn)擊“測本底值”，測得本底值為1.41。（二）樣品測定1. 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)溶液熒光強(qiáng)度的測定在6個(gè)干凈的50 ml 容量瓶中，分別吸取0.50、1.00、1.50，2.00，2.50和3.00維生素B 2標(biāo)準(zhǔn)溶液，各加入2.00 ml 冰乙酸，稀釋至刻度，搖勻。得到不同濃度的溶液分別是：0.1，0.2，0.3，0.5，0.6ug/ml的維生素B

7、2溶液，從稀到濃測量系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度。2. 未知試樣的測定稱取5.0778g 多維葡萄糖粉試樣, 用少量水溶解后轉(zhuǎn)入100 ml 容量瓶中，加2.00 ml 冰乙酸，稀釋至刻度，搖勻。用測定標(biāo)準(zhǔn)系列時(shí)相同的條件，平行測量其熒光強(qiáng)度3次。3. 退出主程序，關(guān)閉計(jì)算機(jī)，先關(guān)主機(jī)，最后關(guān)氙燈。五、數(shù)據(jù)處理:1. 用標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的熒光強(qiáng)度繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線： 0.3 0.4 0.5 0.6 9.223 9.237 9.203 9.221 11.429 14.566 16.923 0.2112% 0.2301% 0.1963% 0.2014% 11.454 11.371 11.461 14.551

8、14.553 14.595 16.873 16.930 16.965 熒光分光光度計(jì)數(shù)據(jù)圖 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 5 10 熒光強(qiáng)度(I 15 y = 0.0383x - 0.0491 R2 = 0.9987 系列 1 濃度(ug/ml 20 2.未知樣品濃度的測定 根據(jù)待測液的熒光強(qiáng)度，從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上求得其濃度，計(jì) 算出試樣中含量。 編號 I C/ug.ml-1 1 48.136 1.795 2 48.133 1.794 3 48.135 1.794 平均值 48.135 1.794 RSD 0.0033% 0.0394% 維生素 B2 百分含量

9、=1.794*100.00/(5.0778*106*100%=0.0035% 1.794*100.00/(5.0778*10 *100%=0.0035% 0.0035 1.794*100.00/ 六、注意事項(xiàng): 注意事項(xiàng): 1.使用 970CRT 時(shí)，要按照儀器使用規(guī)定使用，不可隨意操作； 6 2.使用石英比色皿時(shí)，要注意勿用手直接觸摸比色皿表面，因 握住側(cè)棱。 七、思考題: 思考題: 1.試解釋熒光光度法較吸收光度法靈敏度高的原因? 答：熒光強(qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度成正比，提高激發(fā)光強(qiáng)度，可成 倍提高熒光強(qiáng)度。同時(shí)，提高儀器靈敏度，也可提高熒光光度法 的靈敏度。而對于吸收光度法，無論是提高激發(fā)光強(qiáng)度提高儀器 靈敏度還是提高儀器靈敏度，入射光和出射光同時(shí)增大，其靈敏 度不變