近紅外雙色激光成像系統(tǒng)

1、近紅外雙色激光成像系統(tǒng) 軟件操作指南 （中文版）基因有限公司 2007年3月Odyssey軟件操作指南目 錄第1章 序言.1如何開始.1 權(quán)限.1 ODYSSEY簡介.1 紅外的優(yōu)點.1 雙色紅外染料.1Odyssey檢測系統(tǒng).1 網(wǎng)絡(luò)連接.1 工程模式（Project Model）.2 分析圖像.2下文提示.2第2章 啟動掃描.3工程、掃描和分析.3啟動掃描.3掃描步驟.3停止掃描.6 在掃描過程中關(guān)閉Odyssey軟件.6 在NEW ANALYSIS窗口中完成一次掃描.7其他掃描方法.8第3章 創(chuàng)建新的分析.9 TUTORIAL工程中導入圖像.9創(chuàng)建新分析.10改變圖像外觀.11 旋轉(zhuǎn)圖像

2、.11 裁剪圖像.12打開圖像查看.15第4章 定量.16檢查設(shè)置.16確定濃度標準.17 中心特征.18 大小特征.18 標準品的命名.18 輸入標準品的濃度.19采用標準品進行定量.20對未知樣品定量.21700通道圖形的定量.22使用細節(jié)觀測進行數(shù)據(jù)比較.24打印定量報告.24 報告模板.24 iOdyssey軟件操作指南打印報告.25 保存工程.25第5章 微孔板網(wǎng)格定量.27輸入微孔板指南圖像.27打開方格法分析.27應(yīng)用一個網(wǎng)格模板.28網(wǎng)格表中的數(shù)據(jù)顯示.32網(wǎng)格法定量.32 IN-CELL WESTERN分析.32下文提示.32第6章 條帶大小的確定.33總述.33在指南工程中

3、導入圖像.33檢查設(shè)置.34開始一次新的分析.34增加泳道.36 移動和恢復(fù)泳道.38 移動泳道.38 改變泳道的寬度.38 增加多個泳道.39編輯條帶分子量.41 尋找條帶起始端.41 添加和恢復(fù)條帶分子量.41 刪除條帶分子量.43 輸入每個MW MARKER的大小.45MW線條和MW標樣條帶的聯(lián)系.46 調(diào)整和移動MW線.46MW線在圖片中的應(yīng)用.47標示標樣大小.47生成泳道報告.48 文檔輸出.49工程保存.50第7章 ODYSSEY面板啟動掃描.51啟動掃描.51 掃描過程.51 掃描范圍.51 文件命名規(guī)則.51 查看掃描狀態(tài).52 停止掃描.52下載數(shù)據(jù)并分析.52iiOdys

4、sey軟件操作指南第1章 序言如何開始Odyssey軟件信息可查閱本手冊和用戶指南（Odyssey User Guide），涉及到活體成像的軟件信息請參考活體成像指南（Odyssey In Vivo Imaging Guide）。本章后面的Odyssey簡介也有助于Odyssey的操作。如果需要安裝Odyssey或其軟件，請參閱Odyssey安裝手冊（Odyssey Installation Manual）。最近更新的信息請閱讀Odyssey CD光盤中的Readme文件。用戶指南（User Guide）詳細描述了Odyssey軟件的全部功能。本操作指南更側(cè)重于完成常規(guī)人物的必須操作步驟，如掃

5、描、條帶大小、定量。每章都基于前面章節(jié)的操作，因此最好從頭閱讀。權(quán)限開始本指南之前，請先確定擁有進入Odyssey的控制權(quán)限。管理員用戶可設(shè)置你的進入權(quán)限。啟動一個新的掃描、下載數(shù)據(jù)和分析圖象要求具備控制權(quán)限。Odyssey簡介紅外的優(yōu)點以前可見光譜熒光技術(shù)被廣泛的應(yīng)用于蛋白和核酸檢測成像。然而大多數(shù)成像系統(tǒng)由于在可見光譜內(nèi)具有很強的的背景熒光，而限制了其對膜上大分子的檢測。Odyssey紅外成像系統(tǒng)通過采用近紅外熒光技術(shù)而消除這些障礙。紅外光譜具有低背景熒光可提供比可見光譜熒光更高的信噪，而且靈敏度與化學發(fā)光相當，但不需要化學發(fā)光底物和膠片。雙色紅外染料Odyssey紅外成像系統(tǒng)采用雙色染料

6、同時檢測。雙色檢測增加了更多的檢測能力。如同一張膜上使用兩種不同染料標記的的抗體以檢測兩種不同的蛋白。Odyssey檢測系統(tǒng)Odyssey檢測系統(tǒng)采用兩個完全獨立的檢測通道兩種染料分別檢測。2個二極管激光器分別提供685nm和785nm的光源，2個雪崩式光電二極管經(jīng)過濾后檢測720nm和820nm的熒光。掃描分辨率從21 -337m。關(guān)于檢測系統(tǒng)更詳細的內(nèi)容請參考Odyssey操作員手冊（Odyssey Operators Manual）。網(wǎng)絡(luò)連接Odyssey可被視為一個掃描系統(tǒng)和文件服務(wù)器的組合。安裝有Windows（XP/NT/2000/98/95）的電腦可與Odyssey成像系統(tǒng)直接連

7、接，或者電腦和系統(tǒng)都可被接入局域網(wǎng)。接入局域網(wǎng)后靈活性更大，即掃描可被隨處啟動。安全方案保證用戶只能進入被允許的的文件。管理員可改變進入權(quán)限。1Odyssey軟件操作指南工程模式（Project Model）Odyssey采用工程模式管理您的操作，所有創(chuàng)建的掃描都是一個工程的一部分。工程就是個容器，為相關(guān)掃描的分組提供邏輯路徑。每個掃描的分析數(shù)據(jù)也是工程結(jié)構(gòu)中的一部分。如果一個工程被打開，則可在其中啟動新的掃描。開始掃描掃描可從Odyssey面板、軟件或網(wǎng)絡(luò)瀏覽器中啟動。如果開啟一個掃描，那么掃描參數(shù)如掃描區(qū)域和分辨率都是指定的，這些參數(shù)將被傳給Odyssey，以啟動掃描和采集數(shù)據(jù)。每種染料都

8、有一張獨立的圖像，掃描數(shù)據(jù)被存儲在Odyssey內(nèi)部的硬盤內(nèi)。如果用Odyssey軟件啟動一個掃描，掃描數(shù)據(jù)將實時自動傳輸?shù)诫娔X上。分析圖像掃描結(jié)束后，通過創(chuàng)建分析條帶大小或定量被啟動并成為工程的一部分。當分析被打開，掃描后的兩幅圖片以不同顏色顯示。重疊模式讓數(shù)據(jù)比較更容易，因為同一區(qū)域內(nèi)兩種熒光重疊以第三種顏色顯示?？焖俸唵蔚墓ぞ咦寛D像分析更快捷。軟件提供了條帶大小和定量工具。如果已購買軟件還提供了In-Cell Western模塊和MousePOD模塊。分析結(jié)束后，提供多種可打印的報告格式。下文提示第2章您可學習到如何用Odyssey軟件啟動一個新的掃描。2Odyssey軟件操作指南第2章

9、 啟動掃描工程、掃描和分析Odyssey的所有文件都包含在工程中。每一個工程內(nèi)可包含許多掃描，每個掃描包含一張或兩張TIFF格式的圖像，取決于使用一種還是兩種染料。當一個掃描被分析后，包括分子量大小和定量數(shù)據(jù)。掃描之后，新的分析窗口被打開創(chuàng)建新掃描文件的第一次分析。一個掃描更多地分析可能因為各種原因而被創(chuàng)建，例如，不同用戶的多張膜同時掃描，每個用戶能夠獨立分析圖像中的一部分。如果原始圖像被翻轉(zhuǎn)或旋轉(zhuǎn)過，新的分析可創(chuàng)建以校正圖像的方向。當一閣分析被創(chuàng)建，圖像可被翻轉(zhuǎn)、旋轉(zhuǎn)、裁剪、過濾或去除背景熒光。啟動掃描有3種方式啟動Odyssey掃描：z 儀器面板z 網(wǎng)絡(luò)瀏覽器z Odyssey軟件Odys

10、sey軟件操作見本章。操作面板“一鍵掃描”請見第7章，瀏覽器啟動掃描請見Odyssey Operators Manual。掃描步驟1） 啟動Odyssey軟件并選擇File New，創(chuàng)建一個新工程。注意：掃描通常會被加入已經(jīng)存在的工程而不是新建工程。存在的工程可以通過選擇File Open打開。2） 設(shè)置路徑，替換“user name”為Windows用戶名。在Name處輸入Tutorial作為工程名。（Licor目錄可變化，如果需要可通過Browse按鈕查找目錄）C:Documents and Settingsuser nameMy DocumentslicorOdysseyProjects

11、3） 單擊Scan創(chuàng)建新工程并啟動掃描，將成為Tutorial工程的一部分。4） 在“Scanner Login”窗口，輸入User Name和Password（敏感數(shù)據(jù)）3Odyssey軟件操作指南5） 單擊OK打開掃描控制窗口。掃描控制窗口（Scanner Console）可命名掃描和設(shè)置重要的掃描參數(shù)如尺寸和分辨率6） 在Name處輸入FirstScan作為掃描文件名7） 選擇掃描Group和User name對應(yīng)掃描Group就像Odyssey掃描儀上的目錄，僅限于特定用戶進入8）在Preset的下拉菜單中選擇MembranePreset即已保存的掃描參數(shù)預(yù)設(shè)值，如果重復(fù)掃描，預(yù)設(shè)值比

12、逐個輸入掃描參數(shù)的效率更高。9） 在Description中輸入First Tutorial Scan描述包含在分析報告中選擇預(yù)設(shè)值，將自動的載入全部掃描參數(shù)。每項掃描參數(shù)的簡要說明請見下文，完整信息請見Odyssey User Guide。預(yù)設(shè)值載入后，任何掃描參數(shù)仍可被編輯。下一步就是設(shè)置Scan Area。z Resolution（分辨率），可設(shè)置為21、42、84、169、337m，169m可用于常規(guī)的膜、凝膠和孔板掃描z Quality（質(zhì)量）決定膜上設(shè)定區(qū)域內(nèi)有多少檢測信號組成圖像上的一個像素。Medium較常用z Focus Offset（焦距偏移），若掃膜通常為0，若掃孔板則為

13、3mm，若掃膠則為凝4Odyssey軟件操作指南zzzz 膠厚度的一半（最大4mm） 由于孔板從底部掃描，所以如果掃描孔板則選擇Microplate（flip image） Channels（通道）選擇框用于選擇700通道、800通道或二者都有 Intensity（強度）通常掃膜為5.0，DNA凝膠8.0，蛋白凝膠或孔板5.0 Scan Area（掃描區(qū)域），通過單擊拖曳在網(wǎng)格上畫出矩形區(qū)域，并由此自動產(chǎn)生Origin和Size的值。掃描區(qū)域也可通過手動輸入Origin和Size值設(shè)定10） 雙擊掃描網(wǎng)格清除初始的掃描區(qū)域。單擊網(wǎng)格的左下角，按住鼠標左鍵拖曳并在網(wǎng)格上畫出一個5cm高、20cm

14、寬的矩形，再松開鼠標。網(wǎng)格左下角就是原點(0,0)，表示Odyssey掃描儀掃描面板上的左前角。掃描矩形可在網(wǎng)格任意位置而不必從原點開始掃描重要：掃描區(qū)域一般略大于膜或凝膠的面積。11）設(shè)置掃描區(qū)域后，請注意文件大小每張圖像文件大小盡可能在7M以內(nèi)，最大為14M。見Odyssey User Guide第2章文件大小的詳細內(nèi)容12）如果您沒有準備膜，將隨機的掃描尺放在Odyssey掃描面板的左下角（如圖所示）。注意：放置膜、微孔板和凝膠的注意事項請見Odyssey Operators Manual。箭頭頂端表示掃描面板的原點(0,0)5Odyssey軟件操作指南提示：掃描矩形膜等，長邊沿掃描區(qū)域

15、下邊界水平放置可使掃描得更快。垂直放置則使激光器的行進距離更遠，增加掃描時間13）關(guān)閉Odyssey的上蓋14）在掃描控制窗中單擊Start Scan，把掃描參數(shù)傳輸給Odyssey并開始掃描。 掃描過程中，圖像在Scanner Console窗 口中實時同步顯示 15）在圖像顯示之后，單擊AlterImage Display，選擇LinearManual并增加兩個通道的Sensitivity直到可以看到尺子注意：Alter Image Display僅改變圖像數(shù)據(jù)的顯示，不同于Scanner Console中的Intensity參數(shù)（該參數(shù)調(diào)節(jié)熒光信號的檢測）。在Scanner Consol

16、e窗口底部，狀態(tài)欄中顯示掃描所需時間，進度條表示掃描完成比率掃描膜時，如果條帶或點比較暗時，在Alter Image Display窗口內(nèi)用明暗度和對比度。如果沒有任何熒光信號顯示，則用Linear Manual Sensitivity滑塊增加靈敏度。默認情況下，700和800通道圖像重疊顯示，默認是紅/綠色，兩個通道重疊熒光信號為黃色。如果需要兩個通道獨立顯示，Alter Image Display窗口中的Show This Image選擇框可用于一次僅顯示一個通道的圖像。注意：Adjust Image Curves按鈕也可改變圖像的顯示，見Odyssey User Guide第11章。停止

17、掃描設(shè)定區(qū)域內(nèi)都被掃描后，Odyssey會自動結(jié)束掃描并儲存圖像文件。若需在自動完成之前停止掃描，單擊Scanner Console窗口中的Stop按鈕、或連續(xù)按Odyssey前面板上的Stop鍵兩次。掃描停止后，圖像文件關(guān)閉并保存，文件可被分析。如果放棄掃描并不保存圖像文件，單擊Scanner Console窗口中的Cancel，而不是Stop。在掃描過程中關(guān)閉Odyssey軟件6Odyssey軟件操作指南如果以高分辨率掃描需要很長的時間，可在掃描完成過程中關(guān)閉Odyssey軟件。選擇File Exit，切勿通過單擊Stop或Cancel關(guān)閉Scanner Console窗口。當工程重新被打

18、開時，Odyssey軟件會自動從Odyssey掃描儀上下載已經(jīng)完成的圖像文件。在New Analysis窗口中完成一次掃描Odyssey結(jié)束掃描后，一個New Analysis窗口被打開顯示剛結(jié)束的掃描得到的TIFF圖像文件。這是，TIFF文件儲存在計算機上，與工程在同一個目錄（自動傳輸）。17）分析命名Original Ananlysis18）單擊OK保存未改變的原始圖像下一章將詳述圖像的剪切、翻轉(zhuǎn)和旋轉(zhuǎn)等。單擊OK保存未作任何改變的圖像分析被保存后，可被顯示在Odyssey窗口的導航樹中。19）單擊導航樹中的First Scan，顯示掃描結(jié)束后保存的分析20）雙擊導航樹中的Original

19、 Ananlysis顯示圖像7Odyssey軟件操作指南下一章將描述如何復(fù)制圖像創(chuàng)建一個新的分析。其他掃描方法本章已經(jīng)介紹了膜掃描的方法，同樣的方法通過在Scanner Console窗口中調(diào)節(jié)合適的預(yù)設(shè)值可掃描DNA凝膠和微孔板。掃描微孔板還要求使用一個掃描指南（內(nèi)含），將微孔板放置在已知的位置，可與Microplate2預(yù)設(shè)值匹配。更大通量至6塊微孔板被同事掃描，選擇File Scan Multiple Plates。Odyssey User Guide的第2章和Operators Manual包含更多的單塊孔板和多塊孔板掃描信息。用MousePOD附件如何掃描3只小鼠的方法請見In Vi

20、vo Imaging Guide的第2章。8Odyssey軟件操作指南第3章 創(chuàng)建新的分析在Odyssey窗口左邊的導航樹中，新的掃描列于指定工程下面。單擊正號+，顯示加在掃描后的第一次分析。在Tutorial工程練習中，實際上未掃描真實的樣品。因此本章第一步就是給Tutorial工程導入一組圖像。Tutorial工程中導入圖像所需圖片保存在Odyssey CD光盤中目錄為Tutorial Images，文件名為Q700.tif和Q800.tif。導入圖片創(chuàng)建新的分析后，可開始定量分析（見第4章）。1） 選擇File Open打開第2章中創(chuàng)建的Tutorial工程。2） 選擇File Impo

21、rt Images注意：如果原始掃描文件丟失或被刪除，在File菜單中選擇Import Images通常導入TIFF格式文件。掃描文件（*.scn）是掃描過程中產(chǎn)生的文件之一，包括TIFF文件存儲位置、掃描分辨率等信息3） 輸入QuantScan作為新的掃描名，Origin Analysis為分析名。4）單擊Browse為700通道選擇圖片5） 在文件選擇窗口，在CD驅(qū)動器中文件夾Tutorial Images選擇文件名的Q700.TIF的文件，單擊Open選擇文件800通道圖像路徑會被自動輸入，只要與700通道圖像的目錄相同并以800.tif為后綴6）單擊OK導入兩幅圖像9Odyssey軟件

22、操作指南創(chuàng)建新分析圖像現(xiàn)在被保存在Tutorial工程中。不改變原始圖像，新分析應(yīng)該以原始圖像的拷貝開始。1） 單擊Tutorial工程中的掃描列表QuantScan2） 單擊工具欄中的新分析按鈕，在QuantScan中創(chuàng)建一個新分析也可通過File New Analysis創(chuàng)建新分析3） 在Name中輸入Quant1作為新分析名注意：分析名中請勿使用斜線、冒號、逗號、句號等符號4）Description中輸入“Quantification of Q700 andQ800 Tutorial Images”5）確定已選擇Original Analysis在Available Analyses列表

23、中選擇的分析是新分析的拷貝圖像來源，只有當前掃描的10Odyssey軟件操作指南分析才會被列入表中6）700和800選擇框都被勾選，兩個通道的圖像才都被導入在新分析窗口的Analysis Images欄中，圖像的一部分以兩通道重疊形式顯示，700通道的熒光顯示為紅色，800通道顯示為綠色，雙色重疊以陰影的黃色顯示。在tutorial圖像中沒有熒光重疊。改變圖像外觀新分析窗口中的Analysis Image欄內(nèi)的按鈕可用于改變圖像的外觀。Flip和Rotate可改變圖像的方向。Subtract和Filter可通過背景去除和銳化改變圖像質(zhì)量。Crop可選取圖像的一部分用于分析。Alter Imag

24、e Display可改變明暗度和對比度。注意：Rotate、Subtract和Filter如果使用不當則會改變定量結(jié)果（見Odyssey User Guide第4章）盡管指南圖像不需要改變，但還是看看這些功能如何工作旋轉(zhuǎn)圖像7）單擊Rotate按鈕旋轉(zhuǎn)圖像6）注意：新分析窗口是Odyssey軟件中唯一可進行裁剪、旋轉(zhuǎn)、過濾等功能的窗口。一旦單擊OK關(guān)閉新分析窗口，將成為永久的改變，所以關(guān)閉窗口前圖片的改變方式至關(guān)重要。11Odyssey軟件操作指南8）單擊Counter-Clockwise按鈕，設(shè)置角度為90，再單擊OK圖像若小于90度旋轉(zhuǎn)，可在Free中輸入度數(shù)，但是請注意，若旋轉(zhuǎn)角度不是9

25、0的倍數(shù)時，可因為圖像的改變而改變定量結(jié)果9）由于本分析中的圖像不需要旋轉(zhuǎn)，單擊Undo按鈕恢復(fù)至初始的方向Odyssey軟件具有多重撤銷功能，連續(xù)單擊Undo可按照順序撤銷之前的操作。裁剪圖像在幾張膜同時掃描時，Crop工具可裁剪出每張膜以便獨立分析。如圖中所示，如果想裁剪出雙排點中的前7個點，圖像中由于明暗度和對比度的原因還有一些點沒有顯示出來。裁剪前用Alter Image Display按鈕改變圖像的明暗度、對比度和靈敏度，以顯示所有的點。10）單擊Alter ImageDisplay按鈕打開調(diào)節(jié)圖像顯示窗口12Odyssey軟件操作指南11）增加LinearManual Sensit

26、ivity滑塊直到所有點可見12）單擊OKLinear Manual Sensitivity滑塊改變LI-COR 16位TIFF圖像，8個不同的靈敏度可用。原始圖像的強度范圍決定了最適合的零度敏度值。在指南圖像中，增加每幅圖像的值可看到在最低靈敏度不能看見的點。一般情況下，如果圖像上的條帶或點不能看見的話，可通過Linear Manual Sensitivity滑塊增加靈敏度。若條帶僅僅是模糊，可用Brightness和Contrast滑塊調(diào)節(jié)。全部點出現(xiàn)后，即可在新分析中裁剪每個通道的前七個點。13Odyssey軟件操作指南13）在700（紅）和800（綠）通道前7個點畫出選擇框。單擊圖像左

27、上角，按住鼠標左鍵，拖曳至圖像底部第7排點右邊，再松開鼠標提示：一般裁剪時不需要圖像邊緣的空白部分。如果圖像被剪切的太近，Odyssey軟件將顯示不同的標簽提示。14）單擊Crop裁剪出選擇框內(nèi)的圖像15）單擊OK為新裁剪的圖像創(chuàng)建新分析14Odyssey軟件操作指南打開圖像查看新分析創(chuàng)建后將被加入導航樹中所屬的掃描下面16）雙擊導航樹中的Quant1分析打開圖像17）選擇 File Save保存Tutorial工程如果在新分析中圖像第一次被打開，兩個通道的圖像以重疊方式顯示。圖像查看打開后，需要確定濃度標準。下一章將描述指南圖像如何定量。如果現(xiàn)在停止操作，下次可通過打開Tutorial工程并雙擊Quant1分析重新恢復(fù)。 圖像查看打開時，工具欄內(nèi)的很多工具都被激活，可以開始分析了15O