麥麩發(fā)酵生產(chǎn)混合酶制劑的培養(yǎng)基條件優(yōu)化

1、麥麩發(fā)酵生產(chǎn)混合酶制劑的培養(yǎng)基條件優(yōu)化食品工藝食品研究與開:;筻63.=I麥麩發(fā)酵生產(chǎn)混合酶制劑的培養(yǎng)基條件優(yōu)化張琛,歐仕益,薛楓,張寧(暨南大學食品科學與工程系,廣州510632)摘要:采用SAS軟件中的PlackettBurman及響應曲面中心點組合實驗設計對發(fā)酵生產(chǎn)阿拉伯木聚糖酶和阿魏酸酯酶混合酶制劑的培養(yǎng)基務件進行優(yōu)化.使用PlackettBurman設計評價了8個培養(yǎng)基因素對混合酶制劑產(chǎn)量的影響,得到主要影響因素;以此為基礎,采用響應曲面中心.占組合設計確定了走麩發(fā)酵生產(chǎn)混合酶制荊的最佳培養(yǎng)基條件:麥麩1O%,NHNOO.28%,KH2PO40.2%,MssOa?7H2OO.08%,

2、NaNO3O.31%,pH5.5o關鍵詞:混合酶制劑;SAS;J養(yǎng)基優(yōu)化OPrIMIZATIONOFCUrUREMEDIAFORPRODUCT10NOFERULICACIDESIERASEANDARABINOXYLANASEBYAsPERGlLLUsNlGERZHANGJing,OUShi-yi,XUEFeng,ZHANGNing(DepartmentofFoodScienceandEngineering,JinanUniversity,Guangzhou,510632)Abstract:PlackettBurmandesignandresponsesurfacemethodologywere

3、usedtooptimizefermentationtechnologyforproductionofferulicacidesteraseandarabinoxylanasebyAspergillusniger.Theresultsshowedthattheenzymesproductionwasinfluencedby5factorsamong8factorstestedaccordingtoPlackett-Burmandesign.Tworesponsesurfacemodelsandresponsesurfaceplotswereobtainedbyusingresponsesurf

4、acemethodologytooptimizethesignificantfactors.Theoptimalfermentationconditionswereasfollows:wheatbran10%,NH4N030.28%,KH:PO40.2%,MgSO4”7H2O0.08%,NaNO30.31%,pH5.5.Keywords:mixed-enzymes;SAS;culturemediumoptimization微生物的生長和產(chǎn)酶受碳源,氮源,生長因子,無機鹽等諸多因素影響.采用PlackettBurman和響應曲面進行實驗設計,結果分析,不但可以快速地從眾多影響因素中篩選出顯著影響

5、因子,而且可以對其進行優(yōu)化,組合1到.因該方法快捷,結果可靠,近些年已成功地應用于發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選,酶解工藝和食品加工工藝優(yōu)化等.而SAS軟件又為這兩種方法提供了全面實驗設計,模型建立,因子效應評估,搜索最佳操作條件等操作方法,可以從實驗設計到結果討論全程使用計算機進行輔助工作.研究表明,黑曲霉可利用麥麩發(fā)酵生產(chǎn)阿魏酸酯酶和阿拉伯木聚糖酶的混合酶制劑,兩種酶制劑的聯(lián)合作用可將麥麩,蔗渣,玉米麩等糧,糖加工下腳料高效降解制備低聚糖和反式阿魏酸_3.本研究在前期研究基礎上對發(fā)酵培養(yǎng)基進一步的優(yōu)化,以課題來源:廣州市科技攻關項目編號:2003Z3-E0061作者簡介:歐仕益,男,4l歲,教授,博士.

6、研究方向:功能性食品.期獲得更高的產(chǎn)酶量.1材料與方法1.1菌種黑曲霉(Aspergillusniger)(ATCC16404)購自廣州環(huán)凱生化試劑公司,經(jīng)選育獲得,菌種采用PDA馬鈴薯培養(yǎng)基保藏.1.2原料麥麩由南方面粉集團公司提供,淀粉酶,木瓜蛋白酶購自遠天酶制劑廠.其余試劑均為分析純.1_3混合酶制劑制備發(fā)酵培養(yǎng)基(麥麩+水+相應添加劑)采用搖瓶(250mL)培養(yǎng).培養(yǎng)基于121cI=滅菌30min,冷卻,接入1%黑曲霉菌種.32,130rpm下培養(yǎng)4d后用尼龍布過濾,濾液離心(4000rpm,20min)以脫除菌絲體.取上清液加入(NH4)2SO至終濃度為8O%,4(c下靜置過夜,40

7、00rpm下離心30min,取沉淀(即粗酶)溶于35mLpH=4.5,O.2mol/L=642OO6.Vo1.27.No.1食品i拜究與開發(fā)食品工藝磷酸氫二鈉/0.1mol/L檸檬酸緩沖溶液,制備出混合酶制劑.1.4去淀粉麥麩(DSWB)的制備將新鮮麥麩于105cc下干燥4h,粉碎,按歐仕益等【4的方法采用淀粉酶和木瓜蛋白酶脫除淀粉和蛋白質,樣品烘干,粉碎,過80目備用.1.5酶解條件:將混合酶制劑30mL于40aI=的恒溫水浴震蕩器保溫5min,加入DSWB1g,反應15min,沸水浴終止反應.離心(4000rpm,20min),取上清液稀釋到適當倍數(shù),采用DNS法(3,5一二硝基水楊酸比色

8、法)測定還原糖含量,采用紫外分光光度法測定阿魏酸含量【5j.測定值減去發(fā)酵液中還原糖和阿魏酸的含量即酶解產(chǎn)物量.1.6實驗設計采用PlackettBurman設計和中心點組合設計進行實驗,利用SAS8.2軟件(StatisticalAnalysisSystem,美國北卡羅來納州RaleighSAS軟件公司研制)對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,優(yōu)化培養(yǎng)基的組成.1.6.1PlackettBurman設計實驗對可能影響黑曲霉發(fā)酵麥麩生產(chǎn)混合酶制劑的培養(yǎng)基中的8個因素進行PlackettBurman設計:麥麩/水的比例,葡萄糖,NHNO,KH2PO,MgSO4”7H20,NaNO,花生粕,pH.每個因素測試高(

9、+1),低(一1)兩水平,實驗次數(shù)為12.具體實驗因素以及水平值見表1.表1因素水平代碼及實際取值1.6.2中心組合設計根據(jù)PlackettBurman設計的分析結果,采用響應面設計中的中心點組合設計對NH0,Mg-S0?7H20,NaNO,3個因素進一步優(yōu)化.設置3因素,5水平:最高點(1.6879),次高點(1),中間點(0),次低點(一1),最低點(-1.6879),響應值為二響應,實驗次數(shù)為20,包括5個中心點實驗;其他對混合酶制劑產(chǎn)量影響較小的因素取固定值(麥麩10%,KH040.2%,pH5.5,不添加花生粕和葡萄糖).實驗后,采用SAS對實驗數(shù)據(jù)進行分析,得到兩個響應值的二次多項

10、式數(shù)學模型,并得到極值點的坐標以及響應曲面的3D圖形,2D投影等高線圖形,以此獲得最佳優(yōu)化條件.2結果與討論2.1影響因素顯著性水平的確定根據(jù)PlackettBurman實驗設計進行發(fā)酵實驗,每組重復2次,所得結果見表2.表2n=12的8因素2響應PlackettBurman設計實驗設計因素阿魏酸產(chǎn)量低聚糖產(chǎn)量K(g/g)(mg/g)由表2可見,不同的培養(yǎng)基的組分對阿魏酸酯酶,阿拉伯木聚糖酶的產(chǎn)量有顯著的影響.其中阿魏酸的產(chǎn)量變化幅度從1098.8g/g到3139.7g/g,低聚糖的產(chǎn)量變化幅度從30.6mg/g到137.4mg/g.通過對兩個響應值進行回歸分析(見表3),發(fā)現(xiàn)MgSO?7H2

11、0的濃度對酶產(chǎn)量的正影響最大.而葡萄糖,花生粕,NaNO顯著降低阿魏酸酯酶產(chǎn)量;葡萄糖,花生粕,NILNO,顯著降低阿拉伯木聚糖酶產(chǎn)量(95%水平).對阿魏酸,低聚糖的產(chǎn)量進行回歸分析,得到兩個一元擬合回歸方程:Y阿魏酸=2463.34+27.35X1-288.09X2-56.38X398.17X4+291.51X5245.18X662.89X7+43.63X8(1)Y低i=93.47+6.04Xl-14.55X2-12.78X3-1.27X4+11.88X56.8X8.59X7+2.44X8(2)通過方差分析,表明這兩個模型在or=0.01水平上能足夠地擬合實驗數(shù)據(jù),并且其決定系數(shù)R都大于0

12、.9,說明90%以上的實驗數(shù)據(jù)的可變性可食品工藝食品研究與開發(fā)2oO6.Vo1.27.No.1用此模型解釋.表3PlackettBurman設計對阿魏酸和低聚糖產(chǎn)量的回歸分析結果因素對阿魏酸的回歸分析對低聚糖的回歸分析代碼影響效果t值顯著性水平影響效果t值顯著性水平2.2培養(yǎng)基條件的優(yōu)化根據(jù)PlackettBurman設計的分析結果,實驗對3個培養(yǎng)基因素(NHjIO3,MgSO4?7H2O,NaNO3)進行進一步的優(yōu)化,選擇3因素,5水平,2響應的中心點組合實驗設計,3因素5水平的取值見表4,實驗設計及實驗結果見表5;其它培養(yǎng)條件固定為:麥麩l0%,KH=IO,0.2%,pH5.5,不添加花生

13、粕和葡萄糖.表4中心點組合設計中的三因素五水平的取值XjNHN030.06%一0.7%0.060.20.40.60.7X2MgSO40,04%-0.1%0.040.050.070.090.1X3NaNO30.06%-0.7%0.060.20.40.60.7通過SAS對實驗數(shù)據(jù)進行分析,我們得到關于阿魏酸和低聚糖產(chǎn)量的二次多項式方程:Y=3179.744Xl+13.74X2-29.6X3-45.36Xl一41.7X1X2+5.85XlX3-89.87X2216X2X3-35.64X3(3)Ytltm=205.8-1.56X1-0.62X2-0.07X3-1.77X121.78X1X2+0.93X

14、lX3-2.73X20.78X2X3-1.19X3(4)兩組方程中的二次項系數(shù)均為負數(shù),說明該方程的拋物線的開口向下,Y值有極值點.模型的完備性可通過方差分析以及決定系數(shù)檢驗.方程(3)的方差分析結果為:F回=MSa/MS=16.1I>F9.10.0.01=4.95F欠失=MsLF/MsPE=10.5<F5Ql0l=10.97,決定系數(shù)R2=_0.9355方程(4)的方差分析結果為:F回歸=MSa/MS=13.57>F9.10,l=4.95F欠失=MSJMSpE=4.65<F50.05-5.05,決定系數(shù)R2=0.9256表5中心組合實驗設計及其結果65結果表明兩個模型

15、在a=0.01的水平上回歸顯著,且兩個方程的決定系數(shù)均大于0.9,表明它們可以解釋90%以上的阿魏酸和低聚糖的濃度變化情況,是檢驗阿魏酸酯酶和阿拉伯木聚糖酶產(chǎn)酶變化的理想模型.圖1,圖2為SAS給出的三維響應面以及等高線圖,從圖中可見擬合面存在有最大值.蝤.圈”,圖1阿魏酸產(chǎn)量的響應曲面圈及等高圖(其中Y.為低聚糖的產(chǎn)量,x,x,分別為Mg-SO4和NaNO濃度代碼)根據(jù)圖12和回歸方程(3),(4)分析得到兩個模型的極值點,并由濃度代碼換算為實際的濃度值,見表6.說明當NHNO3為0.27%,MgSO為0.08%,NaNO,為0.29%時,阿魏酸產(chǎn)量達最高值3203.6g/g,即該條件下阿魏

16、酸酯酶產(chǎn)量最高;當NHNO3為0.29%,M:gSO4為0.07%,NaNO3為0.34%時,低聚糖產(chǎn)量產(chǎn)量達最高值208.25mg/g,即該66食品研究與開發(fā)食品工藝低鹽低酸大頭菜加工技術研究汪興平,莫開菊,李麗(湖北民族學院生物科學與技術學院恩施445000)摘要:大頭菜傳統(tǒng)腌制工藝均采用高鹽,口感太成,不利于身體健康,使生產(chǎn)和銷售都受到了限制.本文突破傳統(tǒng)腌制工藝,主要從脫鹽工序方面對大頭菜加工工藝進行研究,力圖使這極普通又價廉的大頭菜,提高到中高檔食品的地位,符合國內外消費趨勢.文章分析了大頭幕規(guī)格,料水比,時間三因素對大頭菜脫鹽工序的影響,探討了加工工藝中主要營養(yǎng)成分氨基酸,Vc含量

17、的變化.結果表明:腌制大頭菜按3mmx3minx40mm的規(guī)格,料水比1:2,脫鹽14min,產(chǎn)品含鹽量為3.21%;但脫鹽工序工藝中氨基酸及維生素c含量影響最大.關鍵詞:大頭菜;低鹽;氨基酸;Vc?TECHN0L0GYs11JDY0NPR0CESsINGOFMUSTARDPIANTINIDWsALTANDIDWACmWANGXingping,MOKai-ju,LILi(其中Y:為低聚糖的產(chǎn)量,X,X:分別為NH4NO和MgSO4濃度代碼)條件下阿拉伯木聚糖酶產(chǎn)量最高.表6響應面的規(guī)范形分析結果取兩者的平均值,即NH4N030.28%,MgSO4?7H200.08%,NaNO30.31%,并添

18、加麥麩1O%,KH2PO0.2%,在初始pH=5.5條件下進行搖瓶培養(yǎng),結果表明,阿魏酸產(chǎn)量的響應值為319060(n=3),低聚糖產(chǎn)量的響應值為2035(n=3).預測值與實驗值之間擬合性好證明了兩個模型有效并存在有極大點.3結論實驗證明了使用SAS對黑曲霉產(chǎn)酶的培養(yǎng)基條件進行優(yōu)化設計和結果分析是十分有效的手段.經(jīng)過系統(tǒng)的實驗設計分析,得到麥麩發(fā)酵生產(chǎn)混合酶制劑的最佳培養(yǎng)基條件為:麥麩lO%,NHnNO0.28%,KH2PO40.2%,MgS04?7H200.08%,NaNO30.31%,pH5.5.在該培養(yǎng)條件下,所得到的阿魏酸酯酶的活性為3203.6(g阿魏酸/gDSWB),所得到的阿拉

19、伯木聚糖酶的活性為206.25(mg低聚糖/gDSWB).參考文獻:1胡良平.WindowsSAS6.12&8.0實用統(tǒng)計分析教程.軍事醫(yī)學科學出版社.2001.2FebeF,AbdulhameedS,MadhavanNKeta1.Useofre-sponsesurfacemethodologyforoptimizingprocessparame-tersfortheproductionofa-amylasebyAspergillusoryzae.BiochemicalEngineeringJournal,2003,15:107-115.3歐仕益,張璩,包惠燕,等.低聚糖和反式阿魏酸的制備方法,發(fā)明專利ZL02134857.X.4OuSY,KaoKR,LiY.AninvitrostudyofwheatbranbindingcapacityforHg,CdandPb.JAgricFoodChem,1999,47(11):4714-