染色體標(biāo)本的制備及組型觀察實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告染色體標(biāo)本的制備及組型觀察1. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆杖旧w標(biāo)本制作的基本方法；認(rèn)識(shí)不同生物的染色體的狀態(tài)，學(xué)會(huì)做染色體組型圖。2. 實(shí)驗(yàn)用品：（ 1）儀器及器材：顯微鏡、載玻片、蓋玻片、鑷子、手術(shù)剪、解剖盤、膠頭滴管、離心管、離心機(jī)、小燒杯、冰箱、酒精燈、小燒杯（ 1）實(shí)驗(yàn)藥品：蒸餾水、 0.9% NaCl 溶液、 0.3% KCl 溶液，固定液（甲醇：冰醋酸 =3:1 ）、秋水仙素（2）實(shí)驗(yàn)材料：小鼠3. 實(shí)驗(yàn)原理：（ 1）制作染色體標(biāo)本的意義：了解染色體的特征（形態(tài)、大小、數(shù)目）繪制染色體組型圖染色體組型：把真核動(dòng)物一個(gè)體細(xì)胞各染色體按長(zhǎng)度、形狀、著絲粒位置排列成一定順序。染色

2、體核型：某一物種特有的一組或一套染色體的形態(tài)特征。（2）染色體組型圖的應(yīng)用鑒別生物種類：兔44 條；小鼠 40 條；大鼠42條；雞 78 條；貓 38 條；狗 78條；馬 64 條遺傳病的診斷和研究：三體綜合征（含三條21號(hào)染色體）、卵巢退化癥（含45 條染色體，比正常人缺少一條性染色體）、睪丸退化癥（含47 條染色體，比正常人多一條X 或 Y 染色體）等因此，我們可以給孕婦抽取羊水檢查器胎兒的染色體，做遺傳病早期診斷。（3）染色體標(biāo)本的制作觀察：由于分裂期中期的染色體染色體凝集程度最高，因而我們應(yīng)盡量使細(xì)胞停留在分裂期中期以便觀察。細(xì)胞：為盡量看到多的染色體，我們應(yīng)當(dāng)選取具有旺盛分裂能力的細(xì)

3、胞，這樣的細(xì)胞可以來(lái)自 : 胸腺、骨髓、睪丸、小腸等。我們?cè)诖藢?shí)驗(yàn)中使用的是小鼠的精巢細(xì)胞。在做人的染色體標(biāo)本時(shí)，我們使用的是血液里的淋巴細(xì)胞。藥物：PHA（植物細(xì)胞凝集素）： PHA具有促進(jìn)細(xì)胞凝集和分裂的作用。 PHA可以使血液中的淋巴細(xì)胞還原至淋巴母細(xì)胞（只存在于骨髓中）1秋水仙素：秋水仙素可以破壞微管的組裝，紡錘體不能形成，細(xì)胞分裂停在中期。與秋水仙素作用相同的藥物還有長(zhǎng)春花堿、鬼臼素、苯環(huán)己烯等。可以促進(jìn)胃管組裝的藥物有紫杉酚、重水等?？諝飧稍铮菏辜?xì)胞與染色體易于分離低滲作用：水進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)容空間變大，染色體距離變大，易于分離、展平。固定： Camoy s solution,使

4、組蛋白變性（變硬），維持染色體原有形態(tài)（ 4）描述染色體的四個(gè)參數(shù) 相對(duì)長(zhǎng)度 =（每條染色體的長(zhǎng)度） / （單倍常染色體之和 +X 染色體） *100相對(duì)長(zhǎng)度可以用來(lái)表示每條染色體的長(zhǎng)度臂指數(shù) =（長(zhǎng)臂的長(zhǎng)度）/( 短臂的長(zhǎng)度 )臂指數(shù)可以用來(lái)確定臂的長(zhǎng)度為了更準(zhǔn)確的區(qū)別亞中部和亞端部著絲粒染色體1964 年 Levan 提出劃分標(biāo)準(zhǔn)：臂指數(shù)在 1.0-1.7 之間，為中部著絲粒染色體（ M）； 1.7-3.0 之間，為亞中部著絲粒染色體（ SM）； 3.0-7.0 之間，為亞端部著絲粒染色體（ ST）；7.0 以上，為端部著絲粒染色體（T）著絲粒指數(shù) =（斷臂長(zhǎng)度） / （染色體全長(zhǎng)）*10

5、0著絲粒指數(shù)可以決定著絲粒的相對(duì)位置按 Levan 的劃分標(biāo)準(zhǔn)， 著絲粒指數(shù)在 50.0-37.5 之間，為 M；37.5-25.0 之間，為 SM； 25.0-12.5 之間，為 ST； 12.5-0.0 之間，為 T 染色體臂數(shù)（ NF），根據(jù)著絲粒的位置來(lái)確定端著絲粒染色體（T）， NF=1中部，亞中部，亞端部著絲粒染色體（M,SM,ST）,NF=2（5）視野中染色體可能是20 或 40 條左右，因?yàn)榧?xì)胞可能處于減數(shù)第一次分裂和減數(shù)第二期分裂時(shí)期。4. 實(shí)驗(yàn)步驟：（1）取雄性小鼠，以每克體重4 微克注射秋水仙素（約1mL），14-16h 后，用斷頭法處死小鼠，取出睪丸用生理鹽水（0.9%

6、 NaCl 溶液）洗去血污，置于解剖盤中。2（2）將睪丸放入裝有1mL 0.3% KCl 溶液的小燒杯中剪碎（液體呈乳白色） 。（3）用銅網(wǎng)過(guò)濾到刻度離心管中，再加0.3% KCl 溶液至 4mL。（4）37靜置 30mins ，低滲處理。（5）以 800-1000r/min離心 8 分鐘。（6）棄上清液，加入2mL 甲醇·冰醋酸固定液。用吸管吹氣，輕輕打散細(xì)胞，固定 8mins 。（7）再以 800-1000r/min 離心 8 分鐘。（8）棄上清液，加入1mL甲醇·冰醋酸固定液制成細(xì)胞懸液，固定5mins 。（9）取去潔凈的低溫預(yù)冷載片，距10-15cm 的高度滴下 2

7、-3 滴細(xì)胞懸液，從一邊輕輕吹氣，并隨時(shí)輕輕敲打，以使細(xì)胞均勻分布和促使染色體展開(kāi)。（10）用濾紙擦去載片上的多余液體，空氣干燥或文火干燥，染色30-35mins 。5. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 視野中可見(jiàn) 細(xì)胞分裂期中期細(xì)胞， 呈棒狀， 有個(gè)別染色體被展開(kāi)呈 V 字形，視野中也可見(jiàn)大量精子，處于分裂期但不是分裂中期的細(xì)胞。10*40 顯微鏡下觀察：（ 1）普通細(xì)胞普通細(xì)胞中，中期染色體40 條（ 2）精子精子中，中期染色體20 條6. 分析與討論（1）結(jié)果分析： 本實(shí)驗(yàn)采用的是小鼠的精巢，所以視野中可見(jiàn)大量的精子，它們有一個(gè)比較圓的頭部和鞭毛，有部分細(xì)胞在進(jìn)行減數(shù)第一次分裂的中期，這樣的細(xì)胞是二倍體，可

8、觀察到 40 條染色體，有些在進(jìn)行減數(shù)第二次分裂中期，這樣的細(xì)胞是單倍體，應(yīng)有 20 條染色體。還有一些細(xì)胞處于細(xì)胞分裂期，但不是中期，可以觀察到凝集程度不是很好的染色體。但是，實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有得到完全展開(kāi)好的染色體，染色體大多呈棒狀而不是 V 字形，這說(shuō)明在對(duì)染色體展平的步驟沒(méi)有做好，以后應(yīng)改進(jìn)。（2）注意事項(xiàng)注射秋水仙素：應(yīng)選擇腹腔注射，如果觀察到小鼠被注射后皮膚隆起，則表明注射到皮下，應(yīng)重新注射；如果在拔出針時(shí)觀察到有血珠溢出，則是因?yàn)樽⑸鋾r(shí)損傷了部分器官或血管， 秋水仙素會(huì)隨血液傳遞到全身， 其傳遞速度會(huì)加快，其死亡時(shí)間可能小于 15-16h ，應(yīng)隨時(shí)觀察小鼠， 以防其突然死亡。 即使注射到

9、3小鼠的腹腔中，也很有可能注射到起脂肪組織中，使小鼠的死亡時(shí)間變慢。因此應(yīng)根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)，適當(dāng)調(diào)整注射時(shí)間和等待時(shí)間。處死小鼠：最好選擇在小鼠將要死亡時(shí)處死小鼠，因?yàn)榇藭r(shí)，秋水仙素的作用發(fā)揮到最大，分裂期中期的細(xì)胞最多；如果等小鼠死亡后處死小鼠，小鼠尸體可能已僵硬，難以取到精巢。剪碎組織：可以取少于1mL0.3% KCl 溶液，沒(méi)過(guò)杯底即可，如果液體太多則很難剪到組織，比較浪費(fèi)時(shí)間。銅網(wǎng)過(guò)濾：應(yīng)把組織盡量剪碎后再用銅網(wǎng)過(guò)濾；如果燒杯中仍有較大顆粒，則小心不要把那些顆粒倒出，在燒杯中再加入少量0.3% KCl 溶液，繼續(xù)剪；如果銅網(wǎng)上還有很多比較大的顆粒，先用少量0.3% KCl 溶液將其沖入燒杯

10、，再進(jìn)行剪碎。實(shí)驗(yàn)步驟中的（ 4）所提到的 30mins 包括包括（ 5）中的離心配平時(shí)間，因此，真正的靜置時(shí)間應(yīng)少于30mins ，細(xì)胞與 0.3% KCl 接觸的總時(shí)間應(yīng)為 45mins左右。另外，由于是在冬季做實(shí)驗(yàn)，我們可適當(dāng)延長(zhǎng)低滲時(shí)間。如果在最后的鏡檢時(shí)，觀察到細(xì)胞呈圓形，比較膨脹，即證明低滲這一步驟的成功。反之，如果低滲不成功，則細(xì)胞會(huì)比較癟，且這樣的細(xì)胞很難摔碎。離心：離心的轉(zhuǎn)速是800-1000r/min ，這樣低的轉(zhuǎn)速是為了防止細(xì)胞破裂。再次離心和固定：這樣做是因?yàn)榈谝淮坞x心之前細(xì)胞經(jīng)過(guò)了低滲處理，雖然抽去了上清液，但是不可能抽干凈，因此，再次離心保證細(xì)胞離開(kāi)低滲環(huán)境。吹散細(xì)

11、胞：應(yīng)該輕輕地吹細(xì)胞，如果太用力會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞破裂。摔碎細(xì)胞：摔碎細(xì)胞時(shí)應(yīng)注意滴管與載玻片的距離，如果距離太小，則細(xì)胞很難摔碎，不會(huì)觀察到染色體；但如果距離太大，會(huì)使細(xì)胞完全的碎開(kāi)，染色體布滿視野，雖然觀察到染色體，但不能明確分出哪些是同一個(gè)細(xì)胞的，會(huì)給計(jì)數(shù)造成一定的難度。實(shí)際操作發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞很難摔碎，這可以歸結(jié)為多方面原因。首先，如果在剪碎組織時(shí)沒(méi)有剪好，則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞勻漿中含有大量細(xì)胞團(tuán)，由于這些細(xì)胞聚集在一起，就有一定的組織強(qiáng)度，十幾厘米的高度很難摔碎，因此，這一步驟十分關(guān)鍵。然后，如果低滲不完全，細(xì)胞可能膨脹程度不夠，很難摔碎。再次，如果混勻細(xì)胞時(shí)沒(méi)有完全混勻，則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞聚集在一起，敲細(xì)胞時(shí)

12、很難敲碎，同樣觀察不到理想的效果；如果吹得太用力，則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞被吹碎，視野中有大量細(xì)胞碎片， 影響觀察。 當(dāng)然，如果摔細(xì)胞時(shí)高度不夠，細(xì)胞不可能被摔碎。? 染色：染色之后應(yīng)沖去染液并晾干，注意使用小水流并從背面沖洗，這樣可以避免沖去細(xì)胞。染 色 體 疾 病 ： 染 色 體 數(shù) 目 或 結(jié) 構(gòu) 異 常 引 起 的 疾 病 稱 為 染 色 體 病 （ chromosomaldisorder）。這類疾病的實(shí)質(zhì)是染色體上的基因或基因群的增減或變位影響了眾多基因的表達(dá)和作用， 嚴(yán)重地破壞了基因的平衡狀態(tài)，因而妨礙了人體相關(guān)器官的分化發(fā)育，造成機(jī)體形態(tài)和功能的異常。嚴(yán)重者在胚胎早期夭折并引起自發(fā)流產(chǎn)，故染

13、色體異常易見(jiàn)于自發(fā)流產(chǎn)胎兒。少數(shù)即使能存活到出生，也往往表現(xiàn)有生長(zhǎng)、智力或性發(fā)育異常和先天性多發(fā)畸形。因此， 染色體病對(duì)人類危害甚大， 且又無(wú)治療良策， 目前主要通過(guò)遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷予以預(yù)防。染色體病表型的輕重程度主要取決于染色體上所累及基因的數(shù)量和功能。染色體病按染色體種類和表型可分為三種：常染色體病、 性染色體病和染色體異常的攜帶者。染色體病在臨床上和遺傳上一般有如下特點(diǎn)： 染色體病患者均有先天性多發(fā)畸形 （包括特殊面容）、生長(zhǎng)、智力或性發(fā)育落后、特殊膚紋；絕大多數(shù)染色體病患者呈散發(fā)性，即雙親染色體正常，畸變?nèi)旧w來(lái)自雙親生殖細(xì)胞或受精卵早期卵裂新發(fā)生的染色體畸變，4這類患者往往無(wú)家族史

14、； 少數(shù)染色體結(jié)構(gòu)畸變的患者是由表型正常的雙親遺傳而得，其雙親之一為平衡的染色體結(jié)構(gòu)重排攜帶者，可將畸變的染色體遺傳給子代，引起子代的染色體不平衡而致病，這類患者常伴有家族史。5p- 綜合征：群體發(fā)病率為 1/50000 ，在智能低兒中約占1% 1.5 ，在小兒染色體病中占1.3 ，在常染色體結(jié)構(gòu)異常病兒中居首位。本病的最主要臨床特征是患兒在嬰幼兒期的哭聲非常似小貓的咪咪聲，有關(guān)研究認(rèn)為是喉部畸形、松馳、軟弱所引起，但也有認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)器官性或功能性病變引起呼氣時(shí)喉部漏氣所致（表14-7 ）。大部分患者能活到兒童，少數(shù)可活到成年。患者5號(hào)染色體短臂缺失的片段大小不一，經(jīng)多個(gè)DAN探針檢測(cè)，

15、證實(shí)5p15為本病缺失片段， 即本病是 5p15缺失引起。 80的病例為染色體片段的單純?nèi)笔Вòㄖ虚g缺失）， 10為不平衡易位引起，環(huán)狀染色體或嵌合體則比較少見(jiàn)。大部分病例的染色體畸變是新發(fā)生的，呈散發(fā)性；但約10% 15患者為攜帶者的子代。13三體綜合征：新生兒中的發(fā)病率約為1/25000 ，女性明顯多于男性。發(fā)病率與母親年齡增大有關(guān)?；颊叩幕伪壬鲜鰞煞N綜合征嚴(yán)重（表14-7 ）。 99以上的胎兒流產(chǎn)，出生后45患兒在 1個(gè)月內(nèi)死亡，90在 6個(gè)月內(nèi)死亡。80的病例為游離型 13三體，即 47， +13；其發(fā)生與母親年齡有關(guān)， 額外的 13號(hào)染色體大多來(lái)自母方第一次減數(shù)分裂的不分離。其次為易位型，從 13q14q為多見(jiàn)，約占易位型的58， 13q13q占 38， 13q15q占 4；易位可以是新生的， 也可能是親代為平衡易位攜帶者遺傳而得。當(dāng)雙親之一是平衡易位攜帶者時(shí)，因絕大多數(shù)異常胎兒流產(chǎn)死亡，出生患兒的風(fēng)險(xiǎn)不超過(guò)2；如果雙親之一為 13q13q易位攜帶者，也由于只能產(chǎn)生三體或單體的合子，流產(chǎn)率可達(dá)100，故不宜妊娠，應(yīng)絕育。少數(shù)病例為與正常細(xì)胞并存的嵌合型，即46/47 ， +13，一般體征較輕。18三體綜合征： 新生兒發(fā)病率約為1/3500 1/8000 ，但在某些地區(qū)或季節(jié)明顯增高，達(dá)到1/450 800。男女性別比為 1:4 ，可能女性易存活?；颊邔m