臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)之藥敏

1、臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)一、 紙片擴(kuò)散法又稱Kirby-Bauer(K-B)法，由于其在抗菌藥物的選擇上具有靈活性，且花費(fèi)低廉，被WHO推薦為定性藥敏試驗(yàn)的基本方法，已在臨床廣泛使用。（一） 實(shí)驗(yàn)原理 將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測(cè)試菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸收瓊脂中的水分溶解后不斷向紙片周圍擴(kuò)散形成遞減的梯度濃度，在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)測(cè)試菌的生長(zhǎng)被抑制，從而形成無(wú)菌生長(zhǎng)的透明圈即為抑菌圈。抑菌圈的大小反映測(cè)試菌對(duì)測(cè)定藥物的敏感程度，并與該藥對(duì)測(cè)試菌的MIC呈負(fù)相關(guān)。（二） 培養(yǎng)基和抗菌藥物紙片1、 抗菌藥物紙片 選擇直徑為6.35mm，吸水量為20µl的專用藥敏紙片，用逐

2、片加樣或侵泡方法使每片含藥量達(dá)規(guī)定所示。含藥紙片密封貯存28或-20無(wú)霜冷凍箱內(nèi)保存，-內(nèi)酰胺類藥敏紙片應(yīng)冷凍貯存，且不超過(guò)一周。使用前將貯存容器移至室溫平衡12小時(shí)，避免開(kāi)啟貯存容器時(shí)產(chǎn)生冷凝水。2、 培養(yǎng)基 水解酪蛋白（Mueller-Hinton,M-H）培養(yǎng)基是CLSI采用的兼性厭氧菌和需氧菌藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，pH為7.27.4，對(duì)那些營(yíng)養(yǎng)要求高的細(xì)菌如流感嗜血桿菌、淋病奈瑟菌、鏈球菌等需加入補(bǔ)充物質(zhì)。瓊脂厚度為4mm。配置瓊脂平板當(dāng)天使用或置塑料密封袋中4保存，使用前應(yīng)將平板置35溫箱孵育15分鐘，使其表面干燥。（三） 實(shí)驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株接種采用直接菌落法或細(xì)菌液體生長(zhǎng)法

3、、用0.5麥?zhǔn)媳葷峁軜?biāo)準(zhǔn)的菌液濃度，校正濃度后的菌液應(yīng)在15分鐘內(nèi)接種完畢。操作步驟如下：1、 接種 用無(wú)菌棉拭子蘸取菌液，在管內(nèi)壁將多余菌液旋轉(zhuǎn)擠去后，在瓊脂表面均勻涂抹接種3次，每次旋轉(zhuǎn)平板60度，最后沿平板內(nèi)緣涂抹一周。2、 貼抗菌藥物紙片 平板置室溫下干燥35分鐘，用紙片分配器或無(wú)菌鑷子將含藥紙片緊貼于瓊脂表面，各紙片中心相距24mm，紙片距平板內(nèi)緣15mm，紙片貼上后不可再移動(dòng)，因?yàn)榭咕幬飼?huì)自動(dòng)擴(kuò)散到培養(yǎng)基內(nèi)。3、 孵育 置35孵育箱1618小時(shí)后閱讀結(jié)果，對(duì)苯唑西林和萬(wàn)古霉素敏感等應(yīng)孵育24小時(shí)。（四） 結(jié)果判斷和報(bào)告 用游標(biāo)卡尺或直尺量取抑菌圈直徑（抑菌圈的邊緣應(yīng)是無(wú)明顯細(xì)菌生

4、長(zhǎng)的區(qū)域），先量取質(zhì)控菌株的抑菌環(huán)直徑，以判斷質(zhì)控是否合格；然后量取試驗(yàn)菌株的抑菌環(huán)直徑。根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)量取的抑菌圈直徑作出“敏感”、“耐藥”、“中介”的判斷。（五） 質(zhì)量控制 對(duì)于腸桿菌科細(xì)菌，M-H瓊脂，生長(zhǎng)法或直接菌落懸液法，相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)的細(xì)菌濃度，35+-2，空氣，1618小時(shí)觀察結(jié)果，質(zhì)控菌株推薦為大腸埃希菌ATCC25922，大腸埃希菌ATCC35218（為監(jiān)控-內(nèi)酰胺酶/-內(nèi)酰胺抑制劑紙片用）；對(duì)于銅綠假單胞菌ATCC35218；對(duì)于葡萄球菌屬細(xì)菌，1618小時(shí)觀察結(jié)果，測(cè)苯唑西林、甲氧西林、萘夫西林和萬(wàn)古霉素需24小時(shí)，試驗(yàn)溫度超過(guò)35不能檢測(cè)甲氧西林耐藥葡萄球菌

5、，推薦質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC25923，大腸埃希菌ATCC35218，紙片擴(kuò)散法檢測(cè)葡萄球菌對(duì)萬(wàn)古霉素的敏感性不可靠；對(duì)于腸球菌屬細(xì)菌，1618小時(shí)觀察結(jié)果，測(cè)萬(wàn)古霉素需24小時(shí)，推薦質(zhì)控菌株為糞腸球菌ATCC29212;對(duì)于流感嗜血桿菌和副流感嗜血桿菌，推薦質(zhì)控菌株為流感嗜血桿菌ATCC49247，流感嗜血桿菌ATCC49766，大腸埃希菌ATCC35218（測(cè)試阿莫西林/克拉維酸時(shí)）；對(duì)于肺炎鏈球菌和肺炎鏈球菌之外其他鏈球菌，培養(yǎng)基為M-H瓊脂+5%羊血，35+-2，5%CO2,2024小時(shí)觀察結(jié)果，推薦質(zhì)控菌株為肺炎鏈球菌ATCC49619.二、 稀釋法（一） 肉湯稀釋法1、

6、培養(yǎng)基 使用M-H肉湯，需氧菌、兼性厭氧菌在此培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好。在該培養(yǎng)液中加入補(bǔ)充成分可支持流感嗜血桿菌、鏈球菌生長(zhǎng)。培養(yǎng)基制備完畢后應(yīng)校正pH為7.27.4（25）。離子校正的M-H肉湯（cation-adjusted Mueller-Hinton broth，CAMHB）為目前推薦的藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)基。2、 藥物稀釋 藥物原液的制備和稀釋遵照CLSI的指南進(jìn)行。3、 菌種接種 配制0.5麥?zhǔn)蠞舛染?，用肉湯（宏量稀釋法）、蒸餾水或生理鹽水（微量稀釋法）稀釋菌液，使最終菌液濃度（每管或每孔）為5x105CFU/ml，稀釋菌液于15分鐘內(nèi)接種完畢，35孵育1620小時(shí)，當(dāng)試驗(yàn)菌為嗜血桿菌屬、鏈球

7、菌屬孵育時(shí)間為2024小時(shí)，葡萄球菌和腸球菌對(duì)苯唑西林和萬(wàn)古霉素的藥敏試驗(yàn)應(yīng)孵育時(shí)間為24小時(shí)。4、 結(jié)果判斷 以在試管內(nèi)或小孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）(µg/ml)。微量稀釋法時(shí)，常借助于比濁計(jì)判別是否細(xì)菌生長(zhǎng)。有時(shí)根據(jù)需要測(cè)定最低殺菌濃度（minimal bactericidal concentration,MBC）;把無(wú)菌生長(zhǎng)的試管（微孔）吸取0.1ml加到冷卻至50M-H瓊脂混合傾注平板，同時(shí)以前述的稀釋1:1000（或1:200）的原接種液作傾注平板，培養(yǎng)4872小時(shí)后計(jì)數(shù)菌落

8、數(shù)，即可得到抗菌藥物的最小殺菌濃度。5、 質(zhì)量控制 對(duì)于常見(jiàn)需氧菌和兼性厭氧菌，M-H瓊脂，孵育時(shí)間、環(huán)境、質(zhì)控菌株同紙片擴(kuò)散法。（二） 瓊脂稀釋法 瓊脂選擇法是將藥物混勻于瓊脂培養(yǎng)基中，配制含不同濃度藥物平板，使用多點(diǎn)接種器接種細(xì)菌，經(jīng)孵育后觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的瓊脂平板所含藥物濃度測(cè)得MIC。1、 培養(yǎng)基 M-H瓊脂為一般細(xì)菌藥敏試驗(yàn)的最佳培養(yǎng)基，調(diào)整pH在7.27.4，pH的過(guò)高或過(guò)低會(huì)影響藥物效能。2、 含藥瓊脂制備 將已稀釋的抗菌藥物按1:9加入在4550水浴中平衡融化M-H瓊脂中，充分混合傾入平皿，瓊脂厚度為34mm。室溫凝固后的平皿裝入密封塑料袋中，置28，貯存日期為

9、5天，對(duì)易降解藥物如頭孢克洛，在使用48小時(shí)之內(nèi)制備平板，使用前在室溫中平衡，放于溫箱中30分鐘使瓊脂表面干燥。3、 細(xì)菌接種 將0.5麥?zhǔn)媳葷岫染合♂?0倍，以多點(diǎn)接種器吸?。s為12µl）接種于瓊脂表面，稀釋的菌液于15分鐘內(nèi)接種完畢，使平皿接種菌量為1 x104CFU/點(diǎn)。接種后置35 孵育1620小時(shí)，特殊藥需要24小時(shí)。奈瑟菌屬、鏈球菌屬細(xì)菌置于5%CO2，幽門(mén)螺桿菌置微需氧環(huán)境中孵育。4、 結(jié)果判斷 將平板置于暗色、無(wú)反光表面上判斷試驗(yàn)終點(diǎn)，以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的藥物稀釋度為終點(diǎn)濃度。藥敏試驗(yàn)的結(jié)果報(bào)告可用MIC（µg/ml）或?qū)φ誄LSI標(biāo)準(zhǔn)用敏感（S）、中介（I

10、）和耐藥（R）報(bào)告。有時(shí)對(duì)于稀釋法的批量試驗(yàn)，需要報(bào)告MIC50、MIC90.MIC50是指抑制50%試驗(yàn)菌的最低藥物濃度，MIC90是指抑制90%試驗(yàn)菌株的最低藥物濃度，例如被測(cè)大腸埃希菌100株，抗菌藥物為頭孢哌酮，在8µg/ml時(shí)可抑制90株大腸埃希菌生長(zhǎng)，此時(shí)頭孢哌酮對(duì)大腸埃希菌的MIC90是8µg/ml。三、E-testE-test法（epsilometer test）是一種結(jié)合稀釋法和擴(kuò)散法原理對(duì)抗菌藥物藥敏試驗(yàn)直接定量的藥敏試驗(yàn)技術(shù)。1.原理 E試條是一種5mmx50mm的無(wú)孔試劑載體，一面固定有一系列預(yù)先制備的，濃度呈連續(xù)指數(shù)增長(zhǎng)稀釋抗菌藥物，另一面有讀數(shù)和

11、判別的刻度?？咕幬锏奶荻瓤筛采w有20個(gè)MIC對(duì)倍稀釋濃度的寬度范圍，其斜率和濃度范圍對(duì)判別有臨床意義的MIC范圍和折點(diǎn)具有較好的關(guān)聯(lián)。 將E試條放在細(xì)菌接種過(guò)的瓊脂平板上，經(jīng)孵育過(guò)夜，圍繞試條明顯可見(jiàn)橢圓形抑菌圈，其邊緣與試條交點(diǎn)的刻度即為抗菌藥物抑制細(xì)菌的最小抑菌濃度。2、 培養(yǎng)基 需氧菌和兼性厭氧菌：M-H瓊脂；MRSA/MRSE：M-H瓊脂+2%NaCl;肺炎鏈球菌：M-H瓊脂+5%脫纖維羊血；厭氧菌：布氏桿菌血瓊脂；嗜血桿菌：HTM；淋病奈瑟菌：GC+1%添加劑。3、 細(xì)菌接種 對(duì)于常見(jiàn)需氧菌和兼性厭氧菌，使用厚度為4mmM-H瓊脂平板，用0.5麥?zhǔn)蠞舛鹊膶?duì)數(shù)期菌液涂布，待瓊脂平板完

12、全干燥，用E試條加樣器或鑷子將試條放在已接種細(xì)菌的平板平面，試條全長(zhǎng)應(yīng)與瓊脂平板緊密接觸，試條MIC刻度面朝上，濃度最大處靠平板邊緣。4、 結(jié)果判斷和報(bào)告 讀取橢圓環(huán)與E試驗(yàn)試條的交界點(diǎn)值，即為MIC。問(wèn)與答：1. 何為藥物敏感性試驗(yàn)？其目的是？測(cè)定抗感染藥物在體外對(duì)病原微生物有無(wú)抑菌或殺菌作用的方法稱為藥物敏感性試驗(yàn)（antibiotic susceptibility test ），簡(jiǎn)稱藥敏試驗(yàn)（AST）。藥敏試驗(yàn)的目的是檢測(cè)可能引起感染的細(xì)菌對(duì)一種或多種抗菌藥的敏感性。事實(shí)上，體外藥敏試驗(yàn)是對(duì)一種抗菌藥在體內(nèi)治療有效性預(yù)測(cè)的先決條件，可供臨床醫(yī)生在治療患者時(shí)合理選擇用藥。此外，藥敏試驗(yàn)還可

13、監(jiān)測(cè)細(xì)菌耐藥性變化。通過(guò)對(duì)某一病房、醫(yī)療機(jī)構(gòu)、地區(qū)或國(guó)家的細(xì)菌耐藥性進(jìn)行流行病學(xué)追蹤，調(diào)整他們的經(jīng)驗(yàn)用藥規(guī)程，定期修訂臨床抗菌譜內(nèi)容，可為醫(yī)院制定預(yù)防措施提供依據(jù)。2. 何為CLSI?我國(guó)藥敏試驗(yàn)結(jié)果判斷參照哪個(gè)標(biāo)準(zhǔn)？CLSI指的是臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（Clinical and Laboratory Standards Institute）(以前稱NCCLS)，是一個(gè)國(guó)際性的、學(xué)科間的、非盈利性的、制定標(biāo)準(zhǔn)的教育機(jī)構(gòu)，它促使人們對(duì)標(biāo)準(zhǔn)和指南達(dá)成共識(shí)并促進(jìn)其在醫(yī)療保健系統(tǒng)內(nèi)的應(yīng)用。在為臨床試驗(yàn)與相關(guān)的醫(yī)療問(wèn)題制定標(biāo)準(zhǔn)和指南時(shí)，CLSI實(shí)施了它所特有的達(dá)成一致的過(guò)程，因而得到全世界的認(rèn)可。若要經(jīng)

14、濟(jì)而有效的提供臨床試驗(yàn)和醫(yī)療保健水平，就應(yīng)該具備一致的標(biāo)準(zhǔn)，這便是CLSI的原則基礎(chǔ)。目前，我國(guó)藥敏試驗(yàn)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)文件，CLSI文件是我國(guó)的衛(wèi)生部部頒文件。3. 藥敏試驗(yàn)報(bào)告中的S、I、R分別表示什么意思？S:敏感（susceptible，S），當(dāng)一種細(xì)菌引起的感染，用某種藥物的常規(guī)量時(shí)治療有效，這種細(xì)菌即對(duì)該藥高度敏感。即常規(guī)用藥時(shí)達(dá)到的平均血藥濃度為對(duì)細(xì)菌的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration,MIC）的5倍或以上。I:中度敏感（intermediate，I），當(dāng)細(xì)菌引起的感染僅在應(yīng)用高劑量抗菌藥時(shí)有效，或者細(xì)菌處于體內(nèi)抗菌藥濃縮

15、的部位或體液（如尿、膽汁、腸腔等）中時(shí)才被抑制，這種細(xì)菌對(duì)該藥僅呈中度敏感。通常用藥時(shí)達(dá)到的平均血藥濃度一般相當(dāng)于或略高于對(duì)細(xì)菌的MIC。對(duì)于毒性較小的藥物，可適當(dāng)加大劑量仍可望獲得臨床療效。R:耐藥（resistant，R），藥物對(duì)某一細(xì)菌的MIC高于藥物在血或體液內(nèi)可能達(dá)到的濃度時(shí)，或有時(shí)細(xì)菌能產(chǎn)生滅活抗菌藥的酶，則無(wú)論其MIC值大小如何，仍應(yīng)判定該菌為耐藥。例如產(chǎn)青霉素酶的金黃色葡萄球菌即應(yīng)認(rèn)為該菌對(duì)青霉素耐藥。12.什么情況下需要做藥敏試驗(yàn)？已查明病原菌，需要幫助醫(yī)師選擇最合適的抗菌藥物者為進(jìn)行細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)和了解本地區(qū)的耐藥性變遷，必須有細(xì)菌藥敏測(cè)定結(jié)果以建立細(xì)菌耐藥性數(shù)據(jù)庫(kù)新抗菌藥

16、物的藥效學(xué)評(píng)價(jià)，必須進(jìn)行藥敏測(cè)定以獲得該藥的MIC50和MIC90，MIC50和MIC90以及抑菌率等評(píng)價(jià)指標(biāo)。以下情況不需要做藥敏測(cè)定：已知某些抗菌藥物對(duì)某種細(xì)菌有良好的抗菌作用，而且很少有耐藥株存在，例如溶血性鏈球菌和腦膜炎奈瑟球菌等可能是污染菌而不是引起發(fā)病的真正病原菌對(duì)一些營(yíng)養(yǎng)要求較高，不易生長(zhǎng)的細(xì)菌，一般也可不做常規(guī)藥敏測(cè)定，例如淋病奈瑟球菌和流感嗜血桿菌。必要時(shí)可進(jìn)行有計(jì)劃的調(diào)查研究。1. 什么是紙片擴(kuò)散法？其原理是？紙片擴(kuò)散法試驗(yàn)就是Kirby-Bauer(K-B)試驗(yàn)，是臨床微生物實(shí)驗(yàn)室最常規(guī)的藥物敏感試驗(yàn)的方法。其原理是：將浸有抗菌藥的紙片貼在涂有細(xì)菌的瓊脂平皿上，抗菌藥在瓊

17、脂內(nèi)向四周擴(kuò)散，其濃度呈梯度遞減，因此在紙片周圍一定距離內(nèi)的細(xì)菌生長(zhǎng)受到抑制，過(guò)夜培養(yǎng)后形成一個(gè)抑菌圈，其直徑大小與藥物濃度的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。通過(guò)游標(biāo)卡尺或直尺對(duì)這些抑菌 圈直徑大小進(jìn)行測(cè)量，然后將測(cè)量結(jié)果與CLSI文件上所列的判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，從而判斷測(cè)試菌株對(duì)各種抗菌藥的敏感性。2、步驟？1）藥敏平皿的制備2）待測(cè)菌的菌液制備3）菌液接種4）含抗菌藥紙片的放置。完成上述3個(gè)步驟后，放入35溫室或溫箱培養(yǎng)1618小時(shí)后閱讀結(jié)果。由于其在抗菌藥物的選擇上具有靈活性，且花費(fèi)低廉，被WHO推薦為定性藥敏試驗(yàn)的基本方法，已在臨床廣泛使用。（六） 實(shí)驗(yàn) 將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測(cè)試菌的瓊脂平

18、板上，紙片中所含的藥物吸收瓊脂中的水分溶解后不斷向紙片周圍擴(kuò)散形成遞減的梯度濃度，在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)測(cè)試菌的生長(zhǎng)被抑制，從而形成無(wú)菌生長(zhǎng)的透明圈即為抑菌圈。抑菌圈的大小反映測(cè)試菌對(duì)測(cè)定藥物的敏感程度，并與該藥對(duì)測(cè)試菌的MIC呈負(fù)相關(guān)。（七） 培養(yǎng)基和抗菌藥物紙片5、 抗菌藥物紙片 選擇直徑為6.35mm，吸水量為20µl的專用藥敏紙片，用逐片加樣或侵泡方法使每片含藥量達(dá)規(guī)定所示。含藥紙片密封貯存28或-20無(wú)霜冷凍箱內(nèi)保存，-內(nèi)酰胺類藥敏紙片應(yīng)冷凍貯存，且不超過(guò)一周。使用前將貯存容器移至室溫平衡12小時(shí)，避免開(kāi)啟貯存容器時(shí)產(chǎn)生冷凝水。6、 培養(yǎng)基 水解酪蛋白（Mueller-H

19、inton,M-H）培養(yǎng)基是CLSI采用的兼性厭氧菌和需氧菌藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，pH為7.27.4，對(duì)那些營(yíng)養(yǎng)要求高的細(xì)菌如流感嗜血桿菌、淋病奈瑟菌、鏈球菌等需加入補(bǔ)充物質(zhì)。瓊脂厚度為4mm。配置瓊脂平板當(dāng)天使用或置塑料密封袋中4保存，使用前應(yīng)將平板置35溫箱孵育15分鐘，使其表面干燥。（八） 實(shí)驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株接種采用直接菌落法或細(xì)菌液體生長(zhǎng)法、用0.5麥?zhǔn)媳葷峁軜?biāo)準(zhǔn)的菌液濃度，校正濃度后的菌液應(yīng)在15分鐘內(nèi)接種完畢。操作步驟如下：4、 接種 用無(wú)菌棉拭子蘸取菌液，在管內(nèi)壁將多余菌液旋轉(zhuǎn)擠去后，在瓊脂表面均勻涂抹接種3次，每次旋轉(zhuǎn)平板60度，最后沿平板內(nèi)緣涂抹一周。5、 貼抗菌藥物紙片 平板置室溫下干燥35分鐘，用紙片分配器或無(wú)菌鑷子將含藥紙片緊貼于瓊脂表面，各紙片中心相距24mm，紙片距平板內(nèi)緣15mm，紙片貼上后不可再移動(dòng)，因?yàn)榭咕幬飼?huì)自動(dòng)擴(kuò)散到培養(yǎng)基內(nèi)。6、 孵育 置35孵育箱1618小時(shí)后閱讀結(jié)果，對(duì)苯唑西林和萬(wàn)古霉素敏感