高效降解纖維素混合菌株的選育

1、高效降解纖維素混合菌株的選育本研究從垃圾堆肥，腐爛稻草，秸稈，樹葉植被覆蓋的土壤中采集，采集地點在學(xué)校工廠周圍，天氣陰天，周圍環(huán)境干燥。根據(jù)多過采樣點來彌補菌種種類少的缺點，更加有利于我們以后菌種來源廣，酶系組成更全；利用菌種之間存在的共生特性，將不同的菌種進行混合培養(yǎng)進行發(fā)酵，以彌補單菌酶組分不全，活性不高的弱點。分離篩選路線圖樣品采集富集培養(yǎng) 濾紙崩解測試分離純化 初篩 單菌篩選 剛果紅識別組合單菌 復(fù)篩 產(chǎn)酶測試固態(tài)產(chǎn)酶測試確定目標(biāo)混合菌目標(biāo)混合菌鑒定紫外線誘發(fā)突變 固態(tài)產(chǎn)酶測試 1富集培養(yǎng)富集培養(yǎng)基 KZHPO40.2%， (NH4)25040.14%， MgS04.7HZO0.03%

2、， CaC120.03%，F(xiàn)eso4· 7HZo5x10一4%， Mnso4i.6xio一4%，znso4i.7xio一4%，eoel22xio一4%，濾紙條2%，pHS.5，i21oC滅菌3omin。富集培養(yǎng)是在目的菌種含量比較少時，根據(jù)能夠分解纖維素菌種的生理特性，設(shè)計一種選擇性培養(yǎng)基，創(chuàng)造有利于該菌種生長條件，使目的菌種在適合的環(huán)境下迅速的生長繁殖，數(shù)量增加。有利于分離到需要的菌種。把各種樣品向各品瓶中注入50mL左右的無菌水，加玻璃珠充分振蕩，以洗下樣品上的微生物，靜置，三層滅菌紗布過濾，再靜置，取濾液中的上清液lmL接種于250mL裝有增殖培養(yǎng)基50mL的三角瓶中。隨后將裝

3、有含取樣菌增殖培養(yǎng)液的錐形瓶置于搖床上以300Or/min、30培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束之后，再將其中的濾紙轉(zhuǎn)入無菌的新鮮增殖培養(yǎng)基中，反復(fù)3次，使利用纖維素的菌株得到富集。2菌株分離2、分離平板培養(yǎng)基梭甲基纖維素培養(yǎng)基(CMC培養(yǎng)基):CMC一 Na15克， NH4No3 1克，酵母膏1 克，Mgso4· 7H2o 0.5克，KH2Po4;1克 H2O 1000mL，瓊脂2%，pH自然，121oC滅菌30min在富集培養(yǎng)之后，為進一步分離純化目的菌株1、移取富集培養(yǎng)液0.lmL于CMC一Na培養(yǎng)基上作平板涂布，30恒溫培養(yǎng)。待平板上長出菌落后，立即挑取，并在CMC一Na平板上進行劃線分

4、離，隨后將長出的單個菌落接種于斜面培養(yǎng)基上進行保存。2、從富集培養(yǎng)液中挑取己潰爛的濾紙片點種于CMC一Na培養(yǎng)基平板30恒溫培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基上濾紙的形態(tài)變化，及其菌株的生長狀況通過對采集到的樣品進行富集培養(yǎng)，并分別對其形成的富集培養(yǎng)液進行平板涂布、劃線分離，共分離得到單菌15株。3各菌株的形態(tài)特征菌種編號形態(tài)特征1菌落呈圓形放射線狀，白色干燥。2菌落白色絨狀，菌絲體覆蓋整個平板，且干燥。3菌落最初為白色絨狀，而且呈顆粒固體狀態(tài)，后逐漸變?yōu)榍嗌?，最后全部變?yōu)榍嗌?，且干燥?菌落圓形初為白色，約72小時后變?yōu)辄S色，濕潤。5菌落圓形 初為白色，22小時后菌落中心出現(xiàn)青黑色，菌落圓形干燥。6菌落白色絨

5、狀向外輻射，干燥培養(yǎng)一短時間變?yōu)榭Х壬?菌落呈丫枝狀向外輻射，為白色8單菌落為白色，較大的圓形，干燥。9菌落極細(xì)小的白色圓形，濕潤，密布于怎個平板。10菌落初為白色，細(xì)小的圓形，濕潤。11菌落為淺黃色，極細(xì)小的圓形，比較濕潤。12菌落為圓形，黃色很濕潤，易挑取。13菌落為白色，在菌落周圍有一圈白色水圈，14菌落為白色，菌落中有一條螺旋線條15菌落呈絨狀白色通過菌種分離得到15種細(xì)菌，把每一種菌種分別放入250ml的錐形瓶中再一次通過富集培養(yǎng)，培養(yǎng)情況如下表組號時間濾紙條分解情況效率%172小時濾紙條分解但是不完全80%272小時濾紙條分解但是不完全56%372小時濾紙條分解完全100%472小

6、時濾紙條分解但是不完全88%572小時濾紙條分解完全87%672小時濾紙條分解但是不完全90%772小時濾紙條分解完全100%872小時濾紙條分解但是不完全75%972小時濾紙條分解但是不完全94%1072小時濾紙條分解完全100%1172小時濾紙條分解完全100%1272小時濾紙條分解但是不完全89%1372小時濾紙條分解完全100%1472小時無變化01572小時無變化016對照組72小時無變化0根據(jù)實驗對比可知14和15組細(xì)菌不能夠產(chǎn)生分解纖維素將的酶。1、 濾紙崩解測試濾紙條鑒定培養(yǎng)基（NH4)SO4;0.10%，KH2PO4;0.10%， MgSO4.7H2O0.05%，K2 HpO

7、40.2%，酵母膏0.01%，濾紙條 (1X7cm)一塊，pH自然。將濾紙條培養(yǎng)基的液體部分分別裝入數(shù)支試管中，每支2mL，并投入一塊50mg(大約 1X6cm )的濾紙條(濾紙經(jīng)烘干后稱重)，滅菌后備用。挑取不同形態(tài)的菌落分別接種于濾紙條培養(yǎng)基的濾紙條上，于30恒溫培養(yǎng)。在CMC培養(yǎng)基上作平板劃線分離，30培養(yǎng)72h后，再將長出的單個菌落接入濾紙條培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天，將接種10天后的濾紙條用水輕輕洗滌，烘干后稱重，計算出失重率。2、 剛果紅纖維素平板識別剛果紅纖維素鑒定培養(yǎng)基: (NH4)2SO40.2%，MgSO4.7玩 00.05%， KHZP040.1%， NaCI0.05%，CMC一

8、Na2.0%，剛果紅0.02%，瓊脂2.0%，pH自然。分離得到的13個單菌菌落分別進行濾紙崩解試驗和剛果紅鑒定，測定結(jié)果見表菌種編號12345678910111213濾紙失重率（%）1153215162238122531361730溶解圈/菌落0.550.270.780.680.700.780.910.690.750.710.780.700.804酶活力的鑒定（1）產(chǎn)酶培養(yǎng)基(g/L)稻草粉90%、鼓皮10%+營養(yǎng)液，比例為59固體加入15mL營養(yǎng)液，pH自然，121oC滅菌60min51。（2）營養(yǎng)液(NH4)250;2%，KHZpO;0.1，MgS04.7HZO0.5%，CaCI:0.0

9、1%，NaCI 0.01%， FeS04.7H200.005%， MnSO4.HZO0.0016%， ZnS04.7HZO0.0014%，CoC12 0.002%。（3）稻草的預(yù)處理先將取得的稻草烘干，剪切至3cm左右，粉碎過40目。然后，將稻草粉置于4%Na0H溶液100水浴 15min，取出用兩層紗布包裹在自來水上沖洗掉堿液，并用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至5.0左右。在105下烘干備用。（1）試劑及緩沖液(l) 二硝基水楊酸試劑(DNS試劑):將7.5克3，5一二硝基水楊酸和14.0克的Na0H充分溶解于1000mL水中，加入216.19酒石酸鉀鈉，5.4mL預(yù)先在50水浴中溶化的苯酚和5.99偏重

10、亞硫酸鈉，充分溶解后置于棕色瓶中，室溫下放置一周后使用153。(2)pH4.8醋酸一醋酸鈉緩沖液。吸取20mL0.Zlnol/L的醋酸和30毗0.Zmol/L的醋酸鈉混勻 (3)0.1%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分析純葡萄糖105干燥到恒重后，準(zhǔn)確稱取100mg，用少量蒸餾水溶解并定容至100mL，冰箱保存?zhèn)溆谩?4)1.omol/LHCL溶液、1.omol/LNa0H溶液。（2）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作取8支比色管，分別按表3.1順序加入各種試劑，將各管溶液混勻后，在722分光光度計上(52Onm)進行比色測定，用空白管溶液調(diào)零后，測定各管光密度值。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線 葡萄糖

11、標(biāo)準(zhǔn)配制項目對照空白1234567含糖總量（mg）00.20.40.60.81.01.21.4葡萄糖液（ml）20.20.40.60.81.01.21.4蒸餾水（ml）21.81.61.41.21.00.80.6DNS試劑（ml）22222222光密度（OD）00.0900.2610.4780.6360.8081.0061.200葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線y = 0.9218x - 0.0993R2 = 0.999400.20.40.60.811.21.400.511.5葡萄糖量(mg)光密度(OD)光密度（OD）線性 (光密度（OD）)由所得數(shù)據(jù)可以看出，吸光度值與葡萄糖含量呈線性正相關(guān)，隨著葡萄糖含量

12、的增加吸光度值也直線遞增，因此只要繪制出二者的關(guān)系圖利用Excel軟件處理數(shù)據(jù)得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程:Y=0.9218X一0.0993，線性相關(guān)系數(shù)R2為0.9994.（3）濾紙酶活(FPA)測定分別于A、B試管中加入pH4.8醋酸一醋酸鈉緩沖液1.omL，及濾紙片(10mmX60mm，約SOmg)各一張，A試管中加入0.5mL適當(dāng)稀釋0.01的酶液(經(jīng)預(yù)熱)，保溫60min后取出加入1.5mLDNS試劑，B試管中補加0.5mL酶液，搖勻后于沸水浴中煮沸8min，取出置于冷水中冷卻至室溫，而后加入蒸餾水稀釋至25mL混勻后在520nm波長處進行比色(B試管作為空白對照)，測出OD值，查閱標(biāo)準(zhǔn)曲線后

13、，求出溶液中的葡萄糖含量。 根據(jù)酶活計算 酶活單位(U)=G*N*60*1000/(o.5*T*MG)葡萄糖拜mol/(mL·h·sooC) （4） 根據(jù)實驗得出光密度OD菌種編號12345678910111213時間5d5d5d5d5d5d5d5d5d5d5d5d5d分光度OD0.13690.07260.62030.24180.29540.17230.48720.10380.20320.25840.26870.23890.4053葡萄糖（mg）0.25650.186480.780660.370080.42820.294660.63630.220320.328140.388

14、080.399240.366840.54378酶活umol/(mL.h)14.2510.3643.3720.5623.7916.3735.3512.2418.2321.5622.1820.3830.21根據(jù)上實驗數(shù)據(jù)可以看出13組數(shù)據(jù)可以看出，第3 ，7 ，13 的酶活是最強的前三組，分別是43.37 umol/(mL.h)，35.35 umol/(mL.h) 和 30.21 umol/(mL.h) 明顯高于其它組的酶活，因此我們選擇第 3 ，7， 和13組進行兩兩組合，因此本試驗要繼續(xù)篩選出降解效果最好的混菌組合。由于天然單菌酶組分單一、配比不均衡，將不同菌種進行混合培養(yǎng)，優(yōu)勢，互補，有利于

15、完善纖維素酶組分，菌種來源廣，酶系組成更全；利用菌種之間存在的共生特性，將不同的菌種進行混合培養(yǎng)進行發(fā)酵，以彌補單菌酶組分不全，活性不高的弱點。確定了三種混菌組合分別為 37 ，3&13 ，7&13分別測定產(chǎn)酶情況，篩選最佳菌種組合。（5）各混合菌的產(chǎn)酶狀況 把每一組組合菌株分別以1:1 接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，培養(yǎng)時間都為5d，最后通過濾紙酶活(FPA)測定測出OD值，查閱標(biāo)準(zhǔn)曲線后，求出溶液中的葡萄糖含量 菌種編號3&73&137&13時間5d5d5d分光度OD0.502280.740544.5615葡萄糖（mg）0.555660.814140.50562酶活umol/(mL.h)30.8745.2330.87人為將兩種天然菌混合在一起培養(yǎng)，使產(chǎn)酶效果達到最佳，降解效率達到最高