EDU 細(xì)胞增殖檢測(cè)

1、熒光顯微鏡檢測(cè)方法(以96孔板，A549貼壁細(xì)胞為例)細(xì)胞培養(yǎng) 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，以每孔4×1031×105細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)至正常生長階段。藥物處理 (可選)客戶可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行各種藥物處理。EdU標(biāo)記 1.1 用細(xì)胞培養(yǎng)基按1000：1的比例稀釋EdU溶液 (試劑A)，制備適量50M EdU培養(yǎng)基； 注：1)EdU濃度與孵育時(shí)間相關(guān)，短時(shí)間孵育(<2h)宜采用高濃度(1050 M)，長時(shí)間孵育(>24h)宜采用低濃度(110M)； 2)如果需配置10M EdU培養(yǎng)基，需調(diào)整為5000：1稀釋比例； 3)配置好的培養(yǎng)基的保存時(shí)間取決于培養(yǎng)基的性質(zhì)。

2、表1 EdU培養(yǎng)基及染色反應(yīng)液的使用量參考 EdU培養(yǎng)基100 l150 l200 l300 l500 l2 mL染色反應(yīng)液100 l150 l200 l300 l500 l2 mL 注：1)*表示貼壁細(xì)胞通常采用的培養(yǎng)容器，EdU培養(yǎng)基與染色反應(yīng)液用量以覆蓋細(xì)胞為宜； 2)懸浮細(xì)胞EdU用量依據(jù)培養(yǎng)體積而定。 1.2 每孔加入100L 50M EdU培養(yǎng)基孵育2小時(shí)，棄培養(yǎng)基； 注：1)最佳孵育時(shí)間與細(xì)胞周期相關(guān)(表2)，大多數(shù)細(xì)胞系均可采用2小時(shí)孵育時(shí)間； 2)EdU培養(yǎng)基用量以沒過細(xì)胞為宜，但需要保證EdU孵育時(shí)間內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)持續(xù)供給(表1)； 1.3 PBS清洗細(xì)胞12次，每次5分鐘。

3、 注：清洗目的是將未滲入DNA的EdU洗脫，清洗方式依據(jù)不同的細(xì)胞類型而定，貼壁不牢的細(xì)胞請(qǐng)降低清洗強(qiáng)度。表2 EdU孵育時(shí)間設(shè)定參考細(xì)胞系人胚胎細(xì)胞酵母細(xì)胞人成纖維細(xì)胞人宮頸癌細(xì)胞人胚腎細(xì)胞系人神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞周期30min3h18h21h25h5d孵育時(shí)間5min20min2h2h2h1d 注： 1)EdU孵育時(shí)間取決于細(xì)胞周期，一般為細(xì)胞周期的1/10至1/5，但大多數(shù)細(xì)胞系均可采用2h孵育時(shí)間。孵育時(shí)間越長，細(xì)胞增殖數(shù)量就越多； 2)*考慮到細(xì)胞培養(yǎng)基、溫度、濕度、光線等其他因素的影響，具體實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞群體細(xì)胞周期會(huì)有所變化。表3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)EdU孵育濃度及時(shí)間參考18272492Salic

4、A, et al. PNAS. 2008NIH3T3, Hela10 nM10 M1 hr18521918Cappella P,et al. Cytometry A. 2008HL-60, A2780, U2OS110 M30 min18996411Chehrehasa F, et al. J Neurosci Methods. 2009Neurospheres120 M24 hr19179371Limsirichaikul S, et al. Nucleic Acids Res. 2009Primary fibroblasts10 M1,2,4 hr19253396Warren M, et

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8、M2hr21878637Li D, et al. J Biol Chem. 2011HCC50 M2hr注：如果您有采用BrdU進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)，可以參照BrdU實(shí)驗(yàn)的相關(guān)參數(shù)進(jìn)行EdU實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞固定化 2.1 每孔加入50L 細(xì)胞固定液 (即含4% 多聚甲醛的PBS)室溫孵育30分鐘，棄固定液； 注：1)低濃度的多聚甲醛有利于細(xì)胞結(jié)構(gòu)的保持，當(dāng)需要抗體染色時(shí)，需采用Triton X-100透化細(xì)胞以利于抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。 2)可采用其他方式進(jìn)行細(xì)胞固定。 2.2 每孔加入50L 2 mg/mL 甘氨酸，脫色搖床孵育5分鐘后，棄甘氨酸溶液； 注：目的是中和多聚甲醛，保證染色反應(yīng)體系，當(dāng)采用其他方式

9、進(jìn)行細(xì)胞固定時(shí)可酌情省略此步驟； 2.3 每孔加入100 L PBS，脫色搖床清洗5分鐘，棄PBS； 2.4 (加強(qiáng))每孔加入100L滲透劑(0.5% TritonX-100的PBS)脫色搖床孵育10分鐘;PBS清洗1次，5分鐘。 注：當(dāng)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行其他抗體染色時(shí)，或由于某些細(xì)胞類型對(duì)染料的吸附性較高，可能需要增強(qiáng)細(xì)胞膜通透性。普通細(xì)胞可以省略。Apollo染色 3.1 每孔加入100 L的1X Apollo®染色反應(yīng)液(表3)，避光、室溫、脫色搖床孵育30分鐘后，棄染色反應(yīng)液； 注：1)染色液用量與細(xì)胞量相關(guān)，以覆蓋細(xì)胞為宜(表1)； 2)孵育時(shí)間可以進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，調(diào)整范圍為103

10、0分鐘。表4 Apollo®染色反應(yīng)液的配置參考(現(xiàn)用現(xiàn)配)1去離子水469 L938 L4.69 mL9.38 mL2Apollo®反應(yīng)緩沖液 (試劑B)25 L50 L250 L500 L3Apollo®催化劑溶液 (試劑C)5 L10 L50 L100 L4Apollo®熒光染料溶液 (試劑D)1.5 L3 L15 L30 L5Apollo®緩沖添加劑 (試劑E)5 mg9 mg44 mg88 mg 注：1)*表示通常配制的Apollo®反應(yīng)液的體積足以進(jìn)行510個(gè)孔(96孔板)染色； 2)按順序配制適量1X Apollo

11、74;染色反應(yīng)液，以免破壞正常的反應(yīng)體系(現(xiàn)用現(xiàn)配，30分鐘用完)； 3)試劑E 為白色粉末，較易氧化，使用后請(qǐng)旋緊管蓋，如試劑出現(xiàn)棕黃色，則需更換； 粉末較難準(zhǔn)確稱量，稱量誤差范圍可稍微放寬，但不應(yīng)超過±20%。 3.2 加入100 L滲透劑(0.5% TritonX-100的PBS) 脫色搖床清洗23次，每次10分鐘，棄滲透劑； 3.3 (加強(qiáng))每孔每次加入100 L 甲醇清洗12次，每次5分鐘；PBS清洗1次，每次5分鐘。 注：由于某些細(xì)胞對(duì)染料的吸附性較高，需采用加強(qiáng)方式洗脫以降低染料背景。普通實(shí)驗(yàn)可以省略。DNA染色 4.1 用去離子水按100：1的比例稀釋試劑F，制備適量

12、1X Hoechst33342反應(yīng)液，避光保存； 4.2 每孔加入100 L 1X Hoechst 33342反應(yīng)液，避光、室溫、脫色搖床孵育30分鐘后，棄染色反應(yīng)液； 4.3 每孔每次加入100 L PBS清洗13次； 4.4 客戶可選擇進(jìn)行其他染色步驟，否則每孔加入100 L PBS保存待用。其他染色(自備) (可選)客戶可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)抗原的抗體染色(注：染料兼容性請(qǐng)參照表4)。圖像獲取及分析 建議染色完成后立即進(jìn)行觀測(cè);如果條件限制，請(qǐng)避光 4 濕潤保存待測(cè)，但不應(yīng)超過3天。 注：調(diào)試儀器時(shí)，請(qǐng)將曝光時(shí)間調(diào)整為30ms左右，盡量不要>1s。表5 配套染料的相關(guān)波長信息C00031*Apollo® 56755