兩株乙酰甲胺磷降解菌的分離鑒定及降解特性研究

1、兩株乙酰甲胺磷降解菌的分離鑒定及降解特性研究于彩虹1 張顯濤1 宋英男1 張帥1 路興波2 孫紅煒2 *（1.中國(guó)礦業(yè)大學(xué)（北京）化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，北京100083；2. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，山東 濟(jì)南 250100）摘要：利用富集及馴化培養(yǎng)方法，從長(zhǎng)期生產(chǎn)農(nóng)藥的企業(yè)廢水處理系統(tǒng)及廠房周邊的污染土壤和池水中，分離篩選出兩株能夠高效降解乙酰甲胺磷的菌株Y3、Y6。在形態(tài)特征和生理生化鑒定的基礎(chǔ)上，對(duì)其16S rDNA序列進(jìn)行了分析，并重點(diǎn)研究了它們對(duì)乙酰甲胺磷及其它農(nóng)藥的降解特性和抗性。結(jié)果表明，Y3、Y6分別為寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas）和假單胞菌（Pseudo

2、monas）。Y3、Y6在乙酰甲胺磷濃度分別為500 mg·L-1和1000 mg·L-1，培養(yǎng)溫度30，初始pH 8.0，接種量為2.5%條件下，一周內(nèi)可以將80%左右的乙酰甲胺磷礦化為磷酸根。外加葡萄糖及酵母膏對(duì)降解效率的研究表明，當(dāng)酵母膏含量為1g·L-1時(shí)，降解效果最理想；而外加葡萄糖的量，會(huì)相對(duì)抑制農(nóng)藥的降解?？剐詫?shí)驗(yàn)顯示，Y3、Y6均可在較高濃度的其它有機(jī)磷類(lèi)及氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的普通培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，對(duì)其它農(nóng)藥的抗性也比較廣泛。植物侵染實(shí)驗(yàn)顯示，Y3、Y6對(duì)試驗(yàn)中的豆科、禾本科、十字花科及葫蘆科植物不具備致病性，說(shuō)明Y3、Y6環(huán)境安全性較強(qiáng)。關(guān)鍵詞：乙酰甲

3、胺磷；菌株；降解特性Isolation, identification and degradation characteristics of two acephate-degrading bacteriaYu Caihong Zhang Xiantao1 Song Yingnan1 Lu Xingbo2 Sun Hongwei2 *(1.School of Chemical and Environmental Engineering, China University of Mining and Technology(Beijing), Beijing 100083;2.Institute o

4、f Plant Protection, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100)Abstract: In this study, by the method of enrichment and domestication, we isolated two strains of bacteria designated as Y-3 and Y-6, respectively, from the wastewater treatment system of the pesticide enterprise as well as

5、 the soil and water around its workplace. The traditional morphology, physio-biochemical characteristics and 16S rDNA gene sequence analysis were applied to the bacteria classification. The characteristics of degrading acephate and the resistance of any other pesticides were also studied. The result

6、s showed that strains Y-3 and Y-6 were identified as Stenotrophomonas sp and Pseudomonas sp. With the initial acephate concentration 500 and 1000 mg·L-1, the initial pH value 8.0, 30, the ratio of bacteria suspension (OD600=2)2.5%, the completely degradation rates were both about 80%. The study

7、 also demonstrated that the optimum content of the yeast extract was 1g·L-1 , while the content of the glucose inhibits the degradation of acephate. The resistance experiments showed that, Y-3 and Y-6 could also be found in higher concentrations of other types of organic phosphorus and carbamat

8、e pesticides in the general growth medium, which have more extensive pesticide resistance. Plant infection experiments showed that, Y-3 and Y-6 almost do not have any pathogenicity on the Leguminosae, Gramineae, Cruciferae and Cucurbitaceae plants, safe to the environment.Key Words: acephate; strain

9、; degradation characteristics乙酰甲胺磷(Acephate)又名高滅磷，化學(xué)名稱(chēng)為O,S-二甲基乙?；虼柞０孵?，是殺蟲(chóng)劑甲胺磷的N-乙?；苌?，分子量183.16，結(jié)構(gòu)式為：乙酰甲胺磷是一種高效、低毒、低殘留、持效期長(zhǎng)、內(nèi)吸性強(qiáng)的廣譜性有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑。從2007年1月1日起， 中國(guó)已全面禁止在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用甲胺磷、對(duì)硫磷、甲基對(duì)硫磷、久效磷、磷胺等5種高毒農(nóng)藥， 乙酰甲胺磷作為替代高毒農(nóng)藥的一種主打產(chǎn)品而廣泛應(yīng)用于我國(guó)蔬菜、果樹(shù)和水稻等作物的害蟲(chóng)防治 1 。2007年乙酰甲胺磷在中國(guó)的產(chǎn)量?jī)H有4000噸，近年來(lái)起產(chǎn)量逐年劇增，有望成為萬(wàn)噸農(nóng)藥品種2。雖然，人們一

10、直認(rèn)為乙酰甲胺磷是一種低毒農(nóng)藥，對(duì)環(huán)境安全性高，被廣泛用于糧食、蔬菜和水果生產(chǎn)中，但近年來(lái)在中國(guó)很多地區(qū)的蔬菜、茶葉及海鮮產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留檢測(cè)中都發(fā)現(xiàn)乙酰甲胺磷的殘留超標(biāo)問(wèn)題3,4,5,6,7，研究表明乙酰甲胺磷在菠菜中代謝較慢，30%的乙酰甲胺磷采用1100ml/hm2的施藥量在15天后，仍能夠檢測(cè)到乙酰甲胺磷的殘留8。乙酰甲胺磷易溶于水，在土壤中易淋溶，易對(duì)水體造成污染，在萊州灣海域部分地區(qū)能檢測(cè)到的乙酰甲胺磷含量較高9。而且乙酰甲胺磷在植物和動(dòng)物體內(nèi)很容易被代謝成毒性更高的甲胺磷。最新的水生物毒理學(xué)研究表明，亞致死濃度的乙酰甲胺磷對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)種群動(dòng)態(tài)具有顯著的影響。隨著乙酰甲胺磷在中

11、國(guó)的大量生產(chǎn)和使用，相關(guān)農(nóng)藥廢水的處理、食品和環(huán)境中乙酰甲胺磷的殘留等問(wèn)題會(huì)越來(lái)越突出，并且農(nóng)藥給環(huán)境帶來(lái)的副作用在使用后很長(zhǎng)時(shí)間才能顯現(xiàn)出來(lái)。因此，如何降低乙酰甲胺磷的污染和殘留問(wèn)題變得日益重要。土壤中的有機(jī)污染物主要是依靠微生物降解，所以利用生態(tài)系統(tǒng)中微生物代謝類(lèi)型的多樣性、生化適應(yīng)能力的極強(qiáng)性以及能迅速產(chǎn)生相應(yīng)酶系的應(yīng)急性，來(lái)快速降解各類(lèi)人工合成的農(nóng)藥，使其完全礦化成無(wú)機(jī)物，是目前最有潛力最有效的研究方法之一10,11。而迄今為止，人們對(duì)于乙酰甲胺磷的微生物降解菌的研究較少。因此，分離篩選具有高效降解乙酰甲胺磷農(nóng)藥的微生物，對(duì)消除農(nóng)藥污染、凈化環(huán)境及社會(huì)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。所

12、以本研究的目的是從農(nóng)藥污水處理池中采樣，通過(guò)富集和馴化培養(yǎng)，獲得以乙酰甲胺磷為唯一碳源的高效代謝菌株，對(duì)其進(jìn)行菌種鑒定，并測(cè)定降解特性及致病性。1 材料與方法1.1 試驗(yàn)材料1.1.1 培養(yǎng)基（均加1L蒸餾水，農(nóng)藥適量添加）液體富集培養(yǎng)基：牛肉膏3g, 蛋白胨10g, NaCl 5g 液體馴化培養(yǎng)基：NaNO3 1.0g, NaCl 0.5g, K2HPO4 1.5g, KH2PO4 0.5g, (NH4)2SO4 0.5g, MgSO40.5g, 酵母膏0.5g （可加入15g瓊脂制成馴化平板劃線分離）降解測(cè)定培養(yǎng)基：KNO3 1.0g，(NH4)2SO4 0.5g，KCl 0.5g，酵母粉

13、0.05g1.1.2 藥品與試劑92%的乙酰甲胺磷原藥（取自山東華陽(yáng)農(nóng)藥集團(tuán)），其它試劑均為分析純（購(gòu)自北京中北林格生物科技有限公司）。1.1.3 樣品采集采自山東華陽(yáng)農(nóng)藥集團(tuán)廠房周邊，以及廠區(qū)污水處理系統(tǒng)曝氣池曝氣泵周?chē)耐翗?、水樣，該廠長(zhǎng)期生產(chǎn)有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑及其它各類(lèi)農(nóng)藥。1.2 菌種的富集與馴化對(duì)取到的樣品先進(jìn)行富集培養(yǎng)，起初選擇藥液的濃度為50mg/L，以周為單位更換培養(yǎng)基并逐步提高農(nóng)藥選擇液的濃度（具體時(shí)間以富集效果而定，有時(shí)適當(dāng)延長(zhǎng)富集培養(yǎng)的時(shí)間）。當(dāng)富集培養(yǎng)液中的選擇液濃度至少達(dá)到500mg/L后，轉(zhuǎn)入馴化培養(yǎng)基培養(yǎng)。配備相應(yīng)的固體培養(yǎng)基平板，馴化過(guò)程涂布觀察以及劃線分離。將得到的

14、菌株在一般環(huán)境下，粗測(cè)降解效率較高的兩株菌命名為Y3、Y6，作為重點(diǎn)研究對(duì)象，并用甘油液封，-20保藏。常用待測(cè)的菌種置于乙酰甲胺磷為5000mg/L的斜面培養(yǎng)基5保藏。1.3 兩株降解細(xì)菌的鑒定1.3.1生理生化特性測(cè)定按照微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)12，對(duì)篩選到的2株細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色、過(guò)氧化氫酶、淀粉水解、尿素反應(yīng)、硝酸鹽還原與糖醇利用等生理生化特性以及溫度、pH值適應(yīng)范圍及耐鹽性的測(cè)定。1.3.2 16S rDNA擴(kuò)增、序列測(cè)定及同源性比較菌株基因組的鑒定采用16S rDNA序列分析的方法。使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取Y3,Y6的基因組DNA，以此為模版PCR大量擴(kuò)增各菌的16S rDNA序列

15、。PCR擴(kuò)增正向引物為F：5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'；反向引物為R：5'-GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3'。PCR反應(yīng)程序：94預(yù)變性5min，94變性30s，54退火50s，72延伸1.5min，30個(gè)循環(huán)，72延伸8min。然后用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。得到的16S rDNA序列擴(kuò)增產(chǎn)物用DNA回收純化試劑盒純化后由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。測(cè)得的序列登陸NCBI網(wǎng)站，通過(guò)Blast程序與Genbank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。1.4 乙酰甲胺磷降解量的檢測(cè)使用鉬藍(lán)比

16、色法13，直接測(cè)定反應(yīng)后培養(yǎng)液中磷酸根離子的質(zhì)量，從而間接確定細(xì)菌直接礦化乙酰的量。菌種在降解測(cè)定培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)一段時(shí)間，取1mL反應(yīng)后培養(yǎng)液定量稀釋加入50mL的容量瓶?jī)?nèi)，然后加入5ml鉬酸銨溶液和3ml抗壞血酸溶液，用水稀釋至刻度,搖勻。于室溫下放置10min后測(cè)定其OD720的值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，求出50mL容量瓶?jī)?nèi)PO43-的濃度WP，進(jìn)而求出1mL待測(cè)液中徹底降解的乙酰甲胺磷的量，公式如下：降解的乙酰的量m=(Wp×M Y)/20×Mp其中MpPO43-的分子量，值為95；MY乙酰甲胺磷的分子量，值為183。降解率w=(1000×m/m0) ×

17、100%m0初始加入的乙酰甲胺磷濃度。1.5 菌母液的制備將各菌接入液體普通培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)，待培養(yǎng)基完全渾濁后以蒸餾水為空白測(cè)定吸光度，加適量生理鹽水將菌液調(diào)至OD600=2.0備用。1.6 環(huán)境條件對(duì)菌株降解乙酰甲胺磷的影響1.6.1 農(nóng)藥濃度對(duì)降解率的影響粗測(cè)得Y3、Y6降解效率相對(duì)較強(qiáng)，單獨(dú)進(jìn)行測(cè)定。農(nóng)藥濃度設(shè)100，200，500，1000，2000mg/L 5個(gè)梯度，初始pH為7.0，2.5%的接種量接菌，于30，150r/min的搖床內(nèi)振蕩培養(yǎng)。一周后測(cè)定乙酰甲胺磷降解量和降解效率。（用1.4節(jié)的方法）1.6.2 初始pH對(duì)降解率的影響選擇Y3、Y6最適宜的農(nóng)藥濃度，初始pH設(shè)5.

18、0，6.0，7.0，8.0，9.0 5個(gè)梯度，其它條件同1.6.1。一周后測(cè)定乙酰甲胺磷降解量和降解效率。1.6.3 接種量對(duì)降解率的影響選擇Y3、Y6最適宜的農(nóng)藥濃度和初始pH，接種量設(shè)0%，1%，2.5%，5%（體積比，所配菌懸母液OD600=2.0） 4個(gè)梯度，其它條件同1.6.1。一周后測(cè)定乙酰甲胺磷降解量和降解效率。1.6.4 酵母膏含量對(duì)降解率的影響選擇Y3、Y6最適宜的農(nóng)藥濃度、初始pH和接種量，酵母膏含量設(shè)0，1，2.5，5g/L 4個(gè)梯度，其它條件同1.6.1。一周后測(cè)定乙酰甲胺磷降解量和降解效率。1.6.5外加葡萄糖量對(duì)降解率的影響選擇Y3、Y6最適宜的農(nóng)藥濃度、初始pH、

19、接種量和酵母膏含量，外加葡萄糖量設(shè)0，2.5，5，10g/L 4個(gè)梯度，其它條件同1.6.1。一周后測(cè)定乙酰甲胺磷降解量和降解效率。1.6.6溫度對(duì)降解率的影響選擇Y3、Y6最適宜的農(nóng)藥濃度、初始pH、接種量、酵母膏含量和外加葡萄糖量，設(shè)20，25，30，35，40 4個(gè)梯度，其它條件同1.6.1。一周后測(cè)定乙酰甲胺磷降解量和降解效率。1.7 降解菌對(duì)其它農(nóng)藥抗性的測(cè)定選擇該農(nóng)藥廠長(zhǎng)期生產(chǎn)的有機(jī)磷類(lèi)的敵敵畏、辛硫磷、毒死蜱、馬拉硫磷、氧化樂(lè)果；氨基甲酸酯類(lèi)的滅多威、克百威、異丙威、速滅威、涕滅威作為外加農(nóng)藥，分別加入富集培養(yǎng)基和馴化培養(yǎng)基。初始濃度為100mg/L，并逐步提高農(nóng)藥濃度至1000

20、mg/L，接種量為1%，于30，150r/min的搖床內(nèi)振蕩培養(yǎng)，48h后通過(guò)測(cè)定OD600的比濁度變化，確定生長(zhǎng)狀況，進(jìn)而表明降解菌對(duì)其它農(nóng)藥的抗性能力。1.8 降解菌的環(huán)境安全性測(cè)定根據(jù)Y3、Y6菌屬鑒定的結(jié)果，參照植病研究方法14，選擇此類(lèi)菌屬較易致病的幾個(gè)科屬(豆科、禾本科、十字花科及葫蘆科）的典型植物作為對(duì)象，使用葉片穿刺的方法，進(jìn)行植物侵染實(shí)驗(yàn)，初步確定其環(huán)境安全性。2 結(jié)果2.1降解菌株的分離與鑒定2.1.1高效降解菌株的確立富集馴化培養(yǎng)的同時(shí)，通過(guò)稀釋平板、劃線分離的方法，分離得到的9株細(xì)菌均能在乙酰甲胺磷濃度5000mg/L以上的農(nóng)藥平板上生長(zhǎng)。然后，逐一檢測(cè)各個(gè)菌株的降解能

21、力。乙酰甲胺磷初始濃度設(shè)置為100，200，500，1000mg/L，用2.4節(jié)的方法檢測(cè)。經(jīng)降解試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)9株菌具有降解乙酰甲胺磷的能力（表1），分別標(biāo)記為：Y1，Y2，Y3，Y4，Y5，Y6，Y7，Y8，Y9。9菌株對(duì)乙酰甲胺磷的降解率對(duì)比發(fā)現(xiàn)，各菌株間差異性較大。從中選出在高農(nóng)藥濃度環(huán)境下降解率較高的Y3和Y6作為研究對(duì)象。表1. 細(xì)菌Y1Y9不同農(nóng)藥濃度下5天對(duì)乙酰的降解效率Table 1 The degradation rate of bacteria Y1Y9 in 5 days on different acephate concentrations100mg/L200mg/L50

22、0mg/L1000mg/LY1Y2Y3Y4Y5Y6Y7Y8Y920.9%35.3%90.7%60.6%34.6%48.3%20.9%18.1%9.2%36.8%54.3%72.1%59.1%12.2%31.0%25.5%14.8%22.4%38.0%62.7%84.6%28.7%14.9%53.6%62.7%33.9%29.7%25.4%42.0%54.2%11.4%12.2%65.9%45.3%31.0%25.1%2.1.2降解菌株的形態(tài)特征及生理生化特性在光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，Y3和Y6分別呈短桿狀和球狀。普通培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)48h后，Y3菌落近圓形、黃褐色、無(wú)光澤、中央稍隆起、邊緣整齊；

23、Y6菌落近圓形、淡黃色、無(wú)光澤、中央凸起、邊緣不整齊，有的呈小齒狀2個(gè)菌株的革蘭氏染色分別呈陰性，有鞭毛。好氣性試驗(yàn)表明2個(gè)菌株均為好氧性菌。它們的生理生化特征以及溫度、pH值適應(yīng)范圍和耐鹽性見(jiàn)表2和表3。表2. 降解菌株的生理生化特性Table 2 Physio-biochemical characteristics of the degrading bacteria生理生化特性Physio-biochemical characteristicsY3Y6淀粉水解Starch hydrolysis過(guò)氧化氫實(shí)驗(yàn)Catalase test吲哚實(shí)驗(yàn) Indol test伏普實(shí)驗(yàn)（V.P）V.P te

24、st甲基紅實(shí)驗(yàn)（M.R）M.R test石蕊牛奶實(shí)驗(yàn)Litmus milk test尿素實(shí)驗(yàn)Urease test明膠水解Gelatine hydrolysis+ + +硫化氫實(shí)驗(yàn)Hydrogen sulfide test檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn) Citrate test葡萄糖發(fā)酵Glucose fermentation蔗糖發(fā)酵Sucrose fermentationD-果糖發(fā)酵D-Fructose fermentationD-木糖發(fā)酵D-Xylose fermentationD-甘露糖發(fā)酵D-Mannose fermentationL-阿拉伯糖發(fā)酵L-Arabinose fermentation+注:

25、“+” 表示菌株反應(yīng)陽(yáng)性，“-” 表示菌株反應(yīng)陰性。Note: The signs “+”, “-”mean the strains positive reaction and negative reaction, respectively.表3. 降解菌株的溫度、pH值與耐鹽性測(cè)定Table 3 The measurement of temperature range, pH value area and salt-tolerance of the degrading bacteria菌株Strains溫度（） Temperature/()pH pH value102030405013591

26、113Y3Y6+菌株Strains氯化鈉濃度（g·L-1）Salt concentration/(g·L-1)10205080100Y3Y6+注: “+” 表示菌株能夠生長(zhǎng)，“-” 表示不能菌株夠生長(zhǎng)。Note: The signs “+”, “-”mean the strains growing and not growing , respectively.2.1.3 降解菌株16S rDNA的PCR擴(kuò)增及分析將所得2菌株的16S rDNA序列結(jié)果通過(guò)Blast程序與Genbank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖2和圖3。結(jié)果表明，菌株Y-3(genbank登錄號(hào)

27、：lcl|28163 )與Y-6(genbank登錄號(hào)：lcl|20815)的16S rDNA序列和嗜性菌的結(jié)構(gòu)相似，其中Y6還具有假單胞菌的序列結(jié)構(gòu)。結(jié)合分離菌株的生理生化等特性（表2和表3）和16S rDNA序列比對(duì)分析結(jié)果，初步鑒定菌株Y3為寡養(yǎng)單胞菌屬，Y6為假單胞菌屬。圖1 菌株Y-3的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Figure 1 The phylogenetic tree of strain Y-3圖2 菌株Y-6的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Figure 2 The phylogenetic tree of strain Y-62.2 環(huán)境條件對(duì)菌株降解乙酰甲胺磷的影響2.2.1 農(nóng)藥濃度對(duì)降解率的影響圖3 Y3、

28、Y6降解率隨農(nóng)藥濃度的變化Figure 3 Y3,Y6 degradation rates change with the concentration of pesticides由圖3可以看出，Y3，Y6的降解效率隨農(nóng)藥濃度的增加而逐漸變大，當(dāng)濃度分別為500mg/L和1000mg/L時(shí)，Y3，Y6的降解效率分別達(dá)到最大的82.18%和82.65%，然后隨著農(nóng)藥濃度的繼續(xù)增加，降解效率開(kāi)始降低，到5000mg/L時(shí)，降解率分別降到23.45%和19.33%。由此說(shuō)明，當(dāng)農(nóng)藥濃度較低時(shí)，細(xì)菌不容易利用，導(dǎo)致降解率較低；隨著濃度提高，單位體積微生物利用的乙酰甲胺磷量越多，細(xì)菌大量生長(zhǎng)，降解率升高；

29、當(dāng)農(nóng)藥濃度超過(guò)一定限度后，農(nóng)藥對(duì)細(xì)菌的毒害作用開(kāi)始顯現(xiàn)，限制其生長(zhǎng)代謝，從而降解率明顯降低。2.2.2 初始pH對(duì)降解率的影響圖4 Y3、Y6降解率隨pH的變化Figure 4 Y3,Y6 degradation rates change with the pH value由圖4可以看出，Y3，Y6的降解率均隨pH升高而變大，其中Y3起始的變化趨勢(shì)基本呈線性上升，當(dāng)pH為8.0時(shí)，兩菌的降解率分別達(dá)到最大的84.35%和80.63%，然后隨著pH的升高，Y3降解率變化不明顯，而Y6則明顯變小。說(shuō)明Y3酸性條件下受pH變化的影響較明顯，偏酸的環(huán)境對(duì)其降解率有明顯抑制，當(dāng)環(huán)境達(dá)到中性或者偏堿性后，

30、降解率基本穩(wěn)定；Y6則是在pH為8.0左右有最大的降解效率，偏酸或者偏堿的環(huán)境都會(huì)對(duì)其產(chǎn)生影響，使降解率變小。2.2.3 接種量對(duì)降解率的影響圖5 Y3、Y6降解率隨接種量的變化Figure 5 Y3,Y6 degradation rates change with the inoculum由圖5可以看出，Y3，Y6降解率隨接種量的變化趨勢(shì)基本一致，當(dāng)接種量為2.5%時(shí)，分別達(dá)到最大值80.63%和81.30%，然后隨接種量的增大，降解率開(kāi)始減小。由此說(shuō)明，在一定范圍內(nèi)，增加接種量可以增加單位體積內(nèi)菌體的數(shù)量，能充分利用環(huán)境中的乙酰甲胺磷進(jìn)行代謝，從而降解率得到提高；當(dāng)菌體密度繼續(xù)增加，單位菌

31、體所對(duì)應(yīng)的底物量相對(duì)減少，菌體間發(fā)生相互競(jìng)爭(zhēng)，反而使降解率變小。2.2.4 酵母膏含量對(duì)降解率的影響圖6 Y3、Y6降解率隨酵母膏含量的變化Figure 6 Y3,Y6 degradation rates change with the content of the yeast extract由圖6可以看出，Y3，Y6的降解率隨酵母膏含量的變化趨勢(shì)基本相同，都是先增大后減小，當(dāng)外加酵母膏含量達(dá)1g/L時(shí)，分別達(dá)到最高的84.05%和80.94%，Y6相對(duì)于Y3的變化幅度較小。由此說(shuō)明，適量提高培養(yǎng)基中的酵母膏含量，提供菌體充足的生長(zhǎng)因子及其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有利于細(xì)菌對(duì)農(nóng)藥底物的降解代謝；當(dāng)超過(guò)一定

32、限度，菌體可能將酵母膏作為主要代謝底物，從而對(duì)農(nóng)藥的降解效率減小。2.2.5 外加葡萄糖量對(duì)降解率的影響圖7 Y3、Y6降解率隨外加葡萄糖含量的變化Figure 7 Y3,Y6 degradation rates change with glucose plus由圖7可以看出，隨著外加碳源葡萄糖的加入，Y3，Y6的降解率均呈明顯下降的趨勢(shì)，其中Y6的下降程度更為明顯。由此說(shuō)明，葡萄糖的加入，可能被菌體優(yōu)先利用作為碳源，而使得菌體代謝農(nóng)藥乙酰甲胺磷的能力減弱，降解率變小。因此對(duì)于Y3，Y6，通過(guò)外加葡萄糖的共代謝作用提高降解率的假設(shè)不成立。2.2.6 溫度對(duì)降解率的影響圖8 Y3、Y6降解率隨溫

33、度的變化Figure 8 Y3,Y6 degradation rates change with temperature由圖8可以看出，隨著溫度的提高Y3,Y6的降解效率均逐步升高，當(dāng)各自升到30和35時(shí)，分別達(dá)到最大的72.26%和70.93%。然后繼續(xù)提高溫度，降解率開(kāi)始降低，其中Y6的變化更加顯著，推測(cè)其原因可能是Y6的農(nóng)藥降解酶活性對(duì)高溫的相對(duì)敏感程度更強(qiáng)。2.3 降解菌對(duì)其它農(nóng)藥抗性的測(cè)定圖9 Y3、Y6在不同農(nóng)藥的普通培養(yǎng)基中的農(nóng)藥抗性Figure 9 Y3,Y6 pesticide resistance in common medium of different pesticid

34、e圖9顯示，Y3、Y6都具備較強(qiáng)較廣泛的抗性。在各農(nóng)藥的馴化培養(yǎng)基內(nèi)，各菌不能正常生長(zhǎng)。說(shuō)明Y3、Y6無(wú)法直接降解利用這些農(nóng)藥作為碳源自身代謝生長(zhǎng)，只是在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富的情況下，對(duì)不同的農(nóng)藥具備廣泛的抗性，而這種抗性，也具有一定的限度。2.4降解菌的環(huán)境安全性測(cè)定圖10 降解菌對(duì)植物侵染實(shí)驗(yàn)結(jié)果（從上到下依次為大豆、玉米、小白菜、西葫蘆；右側(cè)是對(duì)照）Figure 10 The plant infection results of degradating bacterias (followed by soybeans, corn, cabbage, zucchini; blank is on th

35、e right.)由圖10可知，Y3、Y6，對(duì)各科屬的典型植物均不具有致病性，環(huán)境安全性比較理想。3 討論獲取高效有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌的主要途徑是從受污染的土壤、污泥等受污染的環(huán)境介質(zhì)中篩選、馴化、富集和分離。目前，研究較多的主要是細(xì)菌和真菌。細(xì)菌在生化上具有多種適應(yīng)能力，容易誘發(fā)產(chǎn)生突變菌株，在有機(jī)磷農(nóng)藥降解中占有主要地位15。細(xì)菌包括：假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Baccillus)、節(jié)細(xì)菌屬(Arthrabacter)、棒狀桿菌屬(Corynobacterium)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、黃單胞桿菌屬(Xanthamonus)、固瘤細(xì)菌屬(Azo-to

36、monus)、硫桿菌屬(Thiobacillus)等；真菌有：曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Pinicielium)、木霉屬(Trichoderma)、酵母菌等；藻類(lèi)對(duì)有機(jī)磷也有降解作用，如小球綠藻屬(Chorolla)降解甲拌磷、對(duì)硫磷等16,17。假單胞菌屬是最為常見(jiàn)的有機(jī)磷降解細(xì)菌的代表，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者都從土壤中分離到了假單胞菌屬的不同菌株，這些細(xì)菌能夠降解甲基對(duì)硫磷、對(duì)硫磷、蠅毒磷、久效磷、甲胺磷、二嗦農(nóng)、異硫磷，馬拉硫磷、敵敵畏、樂(lè)果、甲拌磷等幾乎所有種類(lèi)的有機(jī)磷農(nóng)藥18。寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)屬于黃單胞菌科(Xanthomonadaceae)，

37、黃單胞菌科原是假單胞菌科(Pseudomonadaceae)的一個(gè)屬，1981年被歸為一個(gè)獨(dú)立的菌科19。寡養(yǎng)單胞菌屬目前確定的種名有S. acidaminiphila、S. dokdonensis、S. koreensis、S. maltophilia、S. nitritireducens、S. rhizophila20,21,22。本研究篩選到的Y3菌株按照16SrDNA分子鑒定結(jié)果應(yīng)為該菌屬中的S. acidaminiphila。寡養(yǎng)單胞菌屬作為農(nóng)藥降解菌的研究相對(duì)較少，國(guó)內(nèi)有關(guān)于寡養(yǎng)單胞菌屬對(duì)除草劑降解的研究23，國(guó)外則多是其對(duì)PAHs（多環(huán)芳香烴）和4NA（4-硝基苯胺）的降解研究2

38、4,25，該類(lèi)菌屬對(duì)于有機(jī)磷農(nóng)藥降解的研究尚屬首例。其中該菌屬的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（S. maltophilia）的研究相對(duì)較多，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌在自然界廣泛分布，在水、土壤、植物根系及食物(冷凍魚(yú)類(lèi)、牛奶、禽蛋等) 等都有該菌的存在；醫(yī)院環(huán)境如透析裝置、氧氣濕化罐、血壓計(jì)、人工呼吸裝置、通氣管道等也都能分離到該菌；同時(shí)該菌也是人和動(dòng)物皮膚、胃腸道和呼吸道較為常見(jiàn)的定植菌。其本身是一類(lèi)多種動(dòng)植物的致病菌26，本文中進(jìn)一步對(duì)所篩選的2株菌株進(jìn)行了植物侵染實(shí)驗(yàn)，所得到的2株菌株對(duì)豆科、禾本科、十字花科中的部分典型植物均不表現(xiàn)致病性，說(shuō)明對(duì)植物的致病性風(fēng)險(xiǎn)較低，但是對(duì)于其動(dòng)物致病性實(shí)驗(yàn)還有待進(jìn)一步的研

39、究。環(huán)境中的污染物通常是多種復(fù)雜的，應(yīng)用微生物去除土壤、水中的污染物，要求菌株對(duì)其他污染物具有較高的抗性。本文中所得到的菌株對(duì)包括有機(jī)磷農(nóng)藥多種農(nóng)藥都存在較強(qiáng)的抗性，尤其對(duì)于氧化樂(lè)果和辛硫磷的抗性很高，很有可能這2種細(xì)菌對(duì)乙酰甲胺磷、氧化樂(lè)果和辛硫磷存在相似的代謝途徑。微生物對(duì)農(nóng)藥等有機(jī)污染物降解有多種途徑, 有的微生物能完全礦化農(nóng)藥為小分子的無(wú)機(jī)物, 有的微生物將農(nóng)藥分子降解為次級(jí)產(chǎn)物, 而次級(jí)產(chǎn)物的積累有可能產(chǎn)生新的環(huán)境污染。本研究中通過(guò)檢測(cè)的微生物將乙酰甲胺磷轉(zhuǎn)化成磷酸根的含量來(lái)確定微生物的代謝活性，因此，這兩種細(xì)菌對(duì)乙酰甲胺磷具有很高的礦化作用，對(duì)于處理農(nóng)藥廢水、進(jìn)一步開(kāi)發(fā)去除農(nóng)藥殘留

40、的菌劑和酶制劑有很好的應(yīng)用前景。4 結(jié)論(Conclusions)（1) 通過(guò)富集馴化培養(yǎng)的方法，篩選到2株高效降解乙酰甲胺磷的細(xì)菌，經(jīng)鑒定分別屬于寡養(yǎng)單胞菌屬和假單胞菌屬，該菌可以將乙酰甲胺磷礦化成磷酸根，具有很好的應(yīng)用效果。（2）Y3降解乙酰甲胺磷的最適條件為：培養(yǎng)溫度為30，pH=8.0，農(nóng)藥初始濃度500mg·L-1，接種量2.5%；Y6降解乙酰甲胺磷的最適條件為：培養(yǎng)溫度為35，pH=8.0，農(nóng)藥初始濃度1000mg·L-1，接種量2.5%。添加一定濃度的酵母膏有利于菌株對(duì)乙酰甲胺磷的降解，當(dāng)濃度為1g/L時(shí)效果最好。葡萄糖的加入則對(duì)各菌降解農(nóng)藥的過(guò)程均產(chǎn)生抑制作

41、用。（3）2菌株對(duì)其它有機(jī)磷及氨基甲酸酯等殺蟲(chóng)類(lèi)農(nóng)藥均具有一定的抗性作用，且環(huán)境安全性較強(qiáng)。參考文獻(xiàn)1 肖洪波,孫光忠,周福榮. 乙酰甲胺磷的生產(chǎn)與應(yīng)用J. 湖北植保,2008(3): 53542 鄭斐能,鄧德峰. 期待乙酰甲胺磷在我國(guó)成長(zhǎng)為萬(wàn)噸級(jí)大品種J. 中國(guó)農(nóng)藥,2009:813.3 Jui-Hung Yen，Kuo-Hsiung Lin，and Yei-Shung wang. Potential of acephate and methamidophos to contaminate GorundwaetrJ. Ecoto.Environ.Saf. 2000(45):7986.4 高海

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