斑馬魚卵液中凝菌物質分離純化及分析

1、斑馬魚卵液中凝菌物質分離純化及分析 一、實驗目的通過生物化學方法，對斑馬魚卵中具有與細菌結合活性的物質進行分離純化，SDS-PAGE電泳后切膠，對目的蛋白進行進一步質譜分析。2、 實驗原理1、 SDS-PAGE聚丙烯酰氨凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠為網狀結構，具有分子篩效應。SDS-PAGE僅根據蛋白質亞基分子量的不同就可以分開蛋白質。蛋白質亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小，而與電荷和分子形狀無關。2、 肽指紋圖譜測定(Peptide Mass Fingerprinting, PMF) 是對蛋白酶解或降解后所得多肽混合物進行質譜分析的方法。質譜分析所得肽斷與多肽蛋白數據庫中蛋白質的理論肽

2、斷進行比較，判斷出所測蛋白是已知還是未知。由于不同的蛋白質具有不同的氨基酸序列，不同蛋白質所得肽斷具有指紋特征。采用肽指紋譜的方法已對多種蛋白質組進行了研究。 基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)是近年來發(fā)展起來的一種新型的軟電離生物質譜，儀器主要由兩部分組成：基質附助激光解吸電離離子源（MALDI）和飛行時間質量分析器（TOF）。MALDI的原理是用激光照射樣品與基質形成的共結晶薄膜，基質從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過程中將質子轉移到生物分子或從生物分子得到質子，而使生物分子電離的過程。因此它是一種軟電離技術，適用于混合物及生物大分子的測定。TOF的原理是離

3、子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據到達檢測器的飛行時間不同而被檢測即測定離子的質荷比（M/Z）與離子的飛行時間成正比 ，檢測離子。MALDI-TOF-MS具有靈敏度高、準確度高及分辨率高等特點，為生命科學等領域提供了一種強有力的分析測試手段，并正扮演著越來越重要的作用。3、 試驗材料與試劑1、實驗動物 斑馬魚(Danio rerio)購自臺東，28于魚缸中培養(yǎng)，24小時通入無菌空氣，每天換水進行養(yǎng)育。 大腸桿菌（E.coli），金黃色葡萄球菌（S.aureus）來自微生物實驗室。2、 實驗試劑 BCA蛋白濃度測定試劑盒：碧云天 P0012 勻漿緩沖液：0.02M Tris-HCl緩沖液 含1

4、00mM NaCl pH=8.0 緩沖液：0.02M Tris-HCl緩沖液 含150mM NaCl 10mM CaCl2 pH=8.0 緩沖液：0.02M Tris-HCl緩沖液含4M尿素 pH=8.0 LB培養(yǎng)基：1000ml去離子水 10g胰化蛋白胨 5g酵母提取物 10g NaCl pH=7.0 15psi高壓下蒸汽滅菌20min4、 實驗步驟1、斑馬魚卵的獲得及卵液制備 將親魚公、母分開飼喂23天（相互之間能夠看到）。喂養(yǎng)時，照明14h黑暗10h交替進行，定時喂以人工顆粒狀餌料。采卵時，取健康性成熟的斑馬魚，按雌雄2：1的比例放入交配缸內，28恒溫過夜，次日68時拔出隔板，獲得受精卵

5、。 將受精卵收集起來，用勻漿緩沖液將卵沖洗干凈，用槍吸取多余水分。用研磨棒將卵搗碎，4 15000g 離心30min，取上清，即為卵液。2、 兩種細菌（G+和G-）的培養(yǎng)準備以及菌濃度測定 將E.coli(G-)和S.aureus（G+）分別接種到LB培養(yǎng)基中。37培養(yǎng)6h，將菌液室溫3000g離心5min，棄去上清，收集菌體。用0.02M Tris-HCl緩沖液重懸菌體，然后3000g離心5min，共洗滌3次，最后用100ul緩沖液重懸菌體。紅細胞計數板法測定菌濃度。3、菌卵孵育，脫洗，超濾濃縮 向上述兩種菌體懸液中加入100ul卵液，混勻后，室溫溫和搖動3h，其中對照組用緩沖液代替卵液，以

6、相同條件進行孵育。孵育后，將菌液與卵液/緩沖液的混合物3000g離心5min，收集菌體后用0.02M Tris-HCl緩沖液重懸菌體，洗滌3次。用100ul緩沖液重懸菌體，室溫搖動1h，洗下菌上結合的蛋白。室溫下3000g離心5min，取上清進行蛋白質超濾濃縮，并用BCA法測定蛋白質濃度。4、SDS-PAGE電泳及分析 配制12%SDS-PAGE凝膠，安裝好電泳儀，在槽中加入SDS電極緩沖液。 取40ul樣品，加入loading10ul，沸水浴8min。按一定順序在加樣孔中加入樣品。 打開電源將電壓調到120v，待樣品跑過壓縮膠后調到200v至樣品電泳到膠底部。 取下凝膠，加入染色液，搖床30

7、min。待條帶清晰后，加入脫色液過夜。 在燈箱下觀察。拍照，分析。5、 實驗結果12%的SDS-PAGE:與陰性對照組相比，在兩種菌的實驗組中116kd/116-66.2kd/35-25kd處均出現了明顯的三條帶。對大腸桿菌做進一步分析：大腸桿菌數目（個/ml）1.4625*109卵液蛋白濃度（mg/ml）6.6092實驗組（E+）蛋白濃度（mg/ml）2.7255對照組（E-）蛋白濃度（mg/ml）3.046110%的SDS-PAGE： 將116kd處的蛋白樣品切膠，送往華大基因進行質譜和肽指紋圖譜鑒定。6、 分析和討論 如圖所見，斑馬魚卵液（稀釋10倍）中含有多種蛋白質，其中有許多母源性免

8、疫因子,如IgM、溶菌酶、凝集素和補體C3等。其對斑馬魚受精卵在充滿大量微生物的體外環(huán)境中發(fā)育，抵抗微生物感染而起到了重要的免疫保護作用。與陰性對照組相比，在實驗組中116kd/116-66.2kd/35-25kd處出現了明顯的三條帶。將116kd處的蛋白樣品切膠，送往華大基因進行質譜和肽指紋圖譜鑒定。由于分析周期較長，結果尚未出來。有資料表明，二齡草魚能與WAL兔抗血清反應,產生特異性條帶,分子量約為25000；甘露糖結合凝集素(MBL)基因片段作為探針,與二齡草魚和45月齡草魚mRNA雜交，表達豐度較高。同時，另有資料表明，MBL分子量大約在30kd左右，猜測斑馬魚卵中具有與細菌結合能力的物質中可能有凝集素類物質。質譜分析用于蛋白質等生物活性分子的研究具有如下優(yōu)點:很高的靈敏度能為亞微克級試樣提供信息,能最有效地與色譜聯(lián)用,適用于復雜體系中痕量物質的鑒定或結構測定,同時具有準確性、易操作性、快速性及很好的普適性，同時具有準確性、易操作性、快速性及很好的普適性。由于質譜法所具有的這些特點使它成為解決生命科學中分析研究的強有力手段，在未知蛋白檢測方面具有廣泛的應用。例如：Johnston一Wilson等聯(lián)合運用2D PAGE與質譜技術在精神分裂癥、抑郁癥、雙相障礙