纖維素柱填料的制備及其在超氧化物歧化酶提純中的應(yīng)用——武漢大

1、纖維素柱填料的制備及其在超氧化物歧化酶提純中的應(yīng)用（武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，武漢 430072）摘要：為制備一種成本較低、具有很高分辨性能和良好物理性能的新型尺寸排除色譜，并通過(guò)超氧化物歧化酶的分離純化，了解有機(jī)試劑沉淀蛋白質(zhì)以及梯度洗脫柱層析方法。將豬血中的超氧化物歧化酶SOD提純出來(lái)，并采用聚乙二醇-2000（PEG2000）和纖維素銅氨溶液共混的方法，通過(guò)柱層析（即尺寸排阻色譜）達(dá)到酶的分級(jí)。關(guān)鍵字：超氧化物歧化酶、纖維素填料、尺寸排阻色譜、梯度洗脫中圖分類號(hào)：O 643文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A0 引言超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，縮寫(xiě)為SOD）廣泛存在于各類生物體

2、內(nèi)。按其所含金屬離子的不同分為3 種：銅鋅超氧化物歧化酶（Cu.Zn-SOD）、錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)和鐵超氧化物歧化酶（Fe-SOD）在生物體內(nèi)，它是一種重要的自由基清除劑，能專一性的清除超氧化物陰離子自由基O2而保護(hù)細(xì)胞，能治療多種炎癥、放射病、自身免疫性疾病和抗衰老，對(duì)生物體有保護(hù)作用。在豬血液里，Cu.Zn-SOD 與血紅蛋白等共存于紅血球。通過(guò)一系列操作可從豬血中提取Cu.Zn-SOD，并通過(guò)DE-32 纖維素陰離子交換柱可得到進(jìn)一步純化。1 實(shí)驗(yàn)部分11.1 試劑與儀器（1）試劑CuSO4.5H2O, 20%NaOH, PEG2000, 棉短絨，4%硫酸，異丙醇，濃氨水，

3、95%乙醇，氯仿，K2HPO4.3H2O ,K2HPO4, 0.9%NaCl, 丙酮，10mmol/L HCl，新鮮豬血500mL，2.5%草酸鉀，甲醛溶液。（2）儀器燒杯，量筒，1000mL分液漏斗，藥匙，洗瓶，抽濾裝置，玻璃攪拌棒，淋洗液瓶，電磁攪拌器，玻璃色譜柱，試管，臺(tái)秤，機(jī)械水泵,電爐，注射器及針頭，回收瓶（Cu(OH)2），紫外分光光度計(jì)（UV-1601 島津），低溫高速離心機(jī)。1.2 實(shí)驗(yàn)步驟1酶的制備（1）取新鮮豬血500 mL（已予先加入50 mL 2.5%草酸鉀作為抗凝劑），3000轉(zhuǎn)/min 離心20 min 除去上層血漿，收集紅細(xì)胞約250 mL，加入等體積的0.9%N

4、aCl溶液，用玻璃棒攪拌充分洗滌，3000轉(zhuǎn)/min 離心20min，棄去上清液（如此反復(fù) 3 次），收集洗凈的紅細(xì)胞放入800 mL 燒杯中，加250 mL 重蒸水，將燒杯置于冰浴中攪拌溶血40 min以上，得溶血液500 mL。（2）往溶血液中緩慢加入在4下預(yù)冷過(guò)的95%的乙醇125 mL（0.25 倍體積），然后再緩緩加入在4下預(yù)冷過(guò)的氯仿75 mL（0.15 倍體積），攪拌15 min，室溫下3000轉(zhuǎn)/min 離心20 min，棄去沉淀（血紅蛋白），收集上清液約330 mL（留樣，為酶1），此即酶的粗提液。（3）往上述液中加入K2HPO4·3H2O130 g，轉(zhuǎn)移到分液漏斗

5、，振蕩后靜置分層（約15min）。收集上層乙醇-氯仿相（微渾濁），室溫下離心（3500轉(zhuǎn)/min）25min，棄去沉淀，得上清夜約100mL(留樣為酶2)。（4）向上一步所得上清夜加入0.75 倍體積在4oC 下預(yù)冷過(guò)的丙酮，Cu·Zn-SOD便沉淀下來(lái)。室溫下3500rpm離心20min ,收集灰白色沉淀物。將此灰白色沉淀物溶于約5mL 重蒸水中（呈懸浮狀，留樣為酶3），在4下，在250mL 200 mmolL-1pH7.6 的磷酸鉀緩沖液中透析，每隔0.5h 換透析液一次，共換4 次。透析內(nèi)液出現(xiàn)沉淀，在室溫下3500轉(zhuǎn)/min離心，棄去沉淀，收集上清液7 mL（留樣，為酶4）。

6、2. 纖維素柱填料的制備（1）制備Cu(OH)216.50gCuSO4.5H2O 加132mLH2O，攪拌加熱至沸后，緩緩加入8mL 25-28 0/0 的濃氨水，并攪拌。冷卻至室溫后，用水將沉淀洗至中性。倒出清液后，加112mL H2O入沉淀中，冰水浴條件下加入53mL 20%NaOH溶液并攪拌，草綠色變?yōu)樘焖{(lán)色，再用水洗至中性，抽濾得天藍(lán)色濕Cu(OH)2（含水率約60%）。（2）制備纖維素銅氨溶液7.60g 纖維素置于47.5g（53mL）濃氨水中，加入13mL 水后密封杯口置于冰箱中冷至10以下。將10.4g 含水率約60%的Cu(OH)2 加入到6.4g（6mL）10%NaOH 里，

7、攪拌均勻后倒入上述冷卻的纖維素氨水溶液中，立即攪拌均勻置于冰箱。冷卻后加13mL 水，繼續(xù)攪拌，再冷卻，再攪拌直至變?yōu)樘m色清亮的粘稠溶液（）。纖維素濃度為8%，溶液總重量約96.43g。（3）柱填料的制備將8.03gPEG-2000 溶于40mL 水，制成20%PEG 水溶液（）。要求溶液（）為藍(lán)色透明粘稠液體，溶液（）應(yīng)為白色透明粘稠液體。各?。ǎ┖停ǎ?0mL，攪拌下混合均勻，得共混液（）。將共混液（）裝入注射器中，注射器前端套上黃色槍頭，均勻用力推出呈絲狀的溶液，直接在10%的NaOH溶液中凝固15min。然后將所得的絲狀物轉(zhuǎn)移到4%的稀硫酸溶液中，放置30min，可以得到透明而均勻的細(xì)

8、絲。用水洗去酸，再把細(xì)絲切成長(zhǎng)為1mm 以下的圓柱體，放在70的水中加熱約1h，以除去其中的PEG-2000。此圓柱體為SEC 柱1#填料。同上法，不用共混液，而直接用纖維素銅氨液（）可制得SEC 柱2#填料。3. 酶的純化和活性測(cè)定（1）纖維素柱層析：將實(shí)驗(yàn)1 所得柱填料1#和2#按體積比1:1 混合并填充玻璃色譜柱，柱體1.5×20cm，填裝時(shí)不要混入氣泡，同時(shí)輕輕敲打管壁，使填料填充緊密，均勻。裝好后，填料的上部用一小團(tuán)棉花覆蓋，以保持膠床頂部平整，不受流入溶劑干擾。用2.5 mmol/LpH7.6 緩沖溶液作平衡液，用2.5mmolL-1(100mL)-200mmolL-1(

9、100mL)pH7.6 的磷酸鉀緩沖溶液.按圖1搭建梯度洗脫裝置進(jìn)行梯度洗脫。流速為40mLh-1，每管收集4mL，收約20管。以H2O為參比，在280nm處采用紫外吸收法測(cè)定每管的吸光度，繪制淋洗曲線。圖1. 梯度洗脫裝置圖（2）鄰苯三酚自氧化速率的測(cè)定在試管中按照表1加入緩沖液，于25 保溫20 min，然后加入預(yù)熱的鄰苯三酚（對(duì)照管用10 mmol/L HCl代替），迅速搖勻，導(dǎo)入1 cm比色皿中，在327 nm處，每隔30 s測(cè)吸光度一次。表1. 測(cè)定鄰苯三酚自氧化速率試劑用量表試劑50 mmol/L pH=8.2 Tris-HCl緩沖液45 mmol/L鄰苯三酚 加入量（mL） 4.

10、5 0.01 最終濃度（mmol/L） 50 0.1總量 4.5 /（3）SOD或粗酶提取液的活性測(cè)定 按照表2加樣，測(cè)定方法同上表2.測(cè)定SOD及粗酶活性的試劑用量表 試劑50 mmol/L pH=8.2 Tris-HCl緩沖液45 mmol/L 鄰苯三酚SOD或粗酶 總量加入量（mL）4.5 0.01 0.01 0.01最終濃度（mmol/L）50 0.1 / /2結(jié)果與討論2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表3.鄰苯三酚的自氧化速率與酶活性測(cè)定結(jié)果編號(hào) 1 1 2 2 3 3 4 4 5 550 mmol/L pH=8.2 Tris-HCl緩沖液4.5 mL 4.5 mL 4.5 mL 4.5 mL 4.

11、5 mL 4.5 mL 4.5 mL 4.5 mL 4.5 mL 4.5 mL10 mmol/L HCl10 L / 10 L / 10 L / 10 L / / 10 L45 mmol/L 鄰苯三酚/ 10 L / 10 L / 10 L / 10 L / 10 L10L酶 不加 不加 酶 1 酶 1 酶 2 酶2 酶 3 酶 3 酶 4 酶 4斜率 0.0950 0.0420 0.0254 0.0093 0.0059 0.0327（稀釋后）單位體積活力（U/mL）= （0.07-樣液速率）/0.070/50% *100 %*反應(yīng)液總體積*（樣液稀釋倍數(shù)/樣液體積） 總活力（U）=單位體積活

12、力（U/mL）*原液總體積按上面兩式，根據(jù)斜率計(jì)算酶活力，得到結(jié)果如表4所示表4.酶的活力計(jì)算結(jié)果樣品 鄰苯三酚自氧化酶1 酶2 酶3 酶4自氧化速率（斜率）0.0950 0.0420 0.0254 0.0093 0.0059單位體積活力（U/mL）/ 502.1053 659.3684 811.8947 844.1053總活力（U）/ 150631.5789 98905.2632 8118.9474 8441.0526酶4稀釋10倍后 0.03275902.1053 59021.0526表5.柱層析紫外吸收數(shù)據(jù)記錄編號(hào)紫外吸收A1（4）編號(hào)紫外吸收A1（4）12346789101112130

13、.017 0.047 1.094 1.060 0.979 0.830 0.676 0.599 0.486 0.358 0.282 0.206 0.142 141516171819 /20 / / / / / / / / / / / / /紫外吸收A2（-20） 0.012 0.007 0.023 0.192 0.564 0.702 0.822 0.899 0.892 0.835 0.729 0.638 0.4870.102 0.701 0.055 0.053 0.051紫外吸收A2（-20） 0.373 0.290 0.226 0.192 0.147 0.129 0.110繪制淋洗曲線如圖2所

14、示圖2. 淋洗曲線表6柱層析后酶活性的測(cè)定結(jié)果樣品 鄰苯三酚2 3 4自氧化速率 自氧化速率（酶放置一天后再測(cè)定） 單位體積活力（U/mL） 總活力U（4mL） 0.1851 0.1326 0.1648 0.17210.1362 0.1377 0.1406 未測(cè)- 2552.6742 987.0340 632.0908- 10210.6969 3948.1361 2528.36302.2討論1在豬血液里，Cu.Zn-SOD 與血紅蛋白等共存于紅血球。當(dāng)紅血球破裂溶血后，用氯仿-乙醇處理溶血液，使血紅蛋白沉淀，而Cu.Zn-SOD 則留在水-乙醇均相溶液中。將磷酸氫二鉀加入水-乙醇均相溶液中時(shí)，

15、由于其極易溶于水，而在乙醇中的溶解度甚低，溶液明顯分層，上層是具有Cu.Zn-SOD 的含水乙醇相，下層是溶有磷酸氫二鉀的水相（比重大）。用分液漏斗分出上層具有SOD 的含水乙醇相，再加入有機(jī)溶劑丙酮，使SOD 沉淀。極性有機(jī)溶劑能導(dǎo)致蛋白質(zhì)脫去水化層，并降低介電常數(shù)而增加帶電質(zhì)點(diǎn)間的相互作用，致使蛋白質(zhì)顆粒凝集而沉淀。采用這種方法沉淀蛋白質(zhì)時(shí)，要求在低溫下操作，并盡量縮短處理時(shí)間，避免蛋白質(zhì)變性。Cu.Zn-SOD的pI為4.95。將上一步收集的SOD 丙酮沉淀物溶于蒸餾水中，在pH7.6 的條件下，Cu.Zn-SOD 帶負(fù)電，過(guò)DE-32 纖維素陰離子交換柱可得到進(jìn)一步純化。2.由于Cu（

16、OH）2在空氣中長(zhǎng)期放置，氧化性會(huì)顯著降低，易和空氣中的CO2形成堿式碳酸銅，因此，需要現(xiàn)用現(xiàn)制。3.在將共混液裝入注射器后，應(yīng)均勻用力推出成絲狀的溶液。但由于注射器過(guò)大且溶液有一定黏度，在注射器前端套一槍頭，再推出絲狀溶液，高聚物熔體擠出物表面隨 而依次出現(xiàn)粗糙、波紋、竹節(jié)甚至破裂現(xiàn)象。在酸洗過(guò)程中，盡量把顏色極深的、體積粗大的填料挑出，防止柱層析的效果不好。4.利用來(lái)源豐富且價(jià)廉的纖維素制備色譜柱填料不僅保護(hù)環(huán)境而且節(jié)約石油資源。從纖維素Ca(SCN)2 溶液，纖維素粘膠液，以及纖維素的17.5%NaOH水溶液已制備了各種SEC 柱填料。這些方法制得的填料，強(qiáng)度高，尺寸穩(wěn)定性好，分辨率高。

17、但由于孔徑太小，分級(jí)范圍很窄，使實(shí)際應(yīng)用受到了很大的限制。而采用聚乙二醇-2000（PEG2000）和纖維素銅氨溶液共混的方法，可制得強(qiáng)度很好的再生纖維素改性多孔膜，其孔徑是未共混的纖維素膜的4 倍，達(dá)到400Å。纖維素共混膜在不同凝固條件下可形成多孔膜，而且其孔徑可以通過(guò)加入的水溶性高分子的種類、分子量和含量進(jìn)行控制。在此基礎(chǔ)上，采用該體系已制備了系列多孔色譜柱填料，在水和有機(jī)溶劑體系中對(duì)多糖進(jìn)行了成功的分級(jí)。這就是此實(shí)驗(yàn)中采用兩種填料共混作為纖維素柱層析填料的原因。5.在提取過(guò)程中，酶的活力隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行逐步降低。酶2比酶1的活力顯著降低，酶3號(hào)樣的活力比酶2號(hào)樣的活力也顯著降低

18、，由此可以推測(cè)出，可能是氯仿、丙酮等有機(jī)溶劑的加入使酶的活力顯著降低。在表3中可以看到，酶4的活力比酶3高，一方面，可能是因?yàn)橥肝銮昂竺傅幕盍ψ兓淮?，測(cè)定本身也有誤差，另一方面，可能是透析前的酶提取液含有少量雜質(zhì)比如丙酮，對(duì)酶的活力有一定的抑制作用。酶4稀釋10倍后測(cè)得的酶活力顯著提高。分析原因?yàn)?，在稀釋前，酶?duì)底物已經(jīng)飽和，有一部分酶并沒(méi)有真正發(fā)揮作用，但是我們卻認(rèn)為所有酶都參與進(jìn)來(lái)了。而稀釋后，充分發(fā)揮了酶的作用，所以測(cè)得的酶活力也相應(yīng)提高。所以，在測(cè)定酶活力時(shí)，如果酶的濃度很高，應(yīng)該稀釋一定倍數(shù)后在進(jìn)行測(cè)定才比較準(zhǔn)確。5.從表5中數(shù)據(jù)可以看出，由于4條件下保存的酶在淋洗時(shí)，開(kāi)始一部分潑

19、灑少量，所以采用-20條件下保存的酶淋洗的吸光度繪制淋洗曲線。6. 從表6中數(shù)據(jù)可以看出，第一次測(cè)定時(shí)鄰苯三酚本身的自氧化速率偏大，根據(jù)酶2、3、4的斜率變化可初步推測(cè)，酶有活性。放置一天后，對(duì)酶再次測(cè)定，斜率基本穩(wěn)定，推測(cè)酶完全失活。3結(jié)論本次實(shí)驗(yàn)制備了纖維素柱填料、并用其基本提純了超氧化物歧化酶，其中酶的活性隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行逐步降低，加入丙酮以及長(zhǎng)時(shí)間保存后，活性顯著降低，但可以肯定，提取出來(lái)的超氧化物歧化酶是有活性的。致謝感謝田沺老師的悉心指導(dǎo)，感謝同組同學(xué)的合作幫助，感謝預(yù)備室老師為我們提供各種儀器和試劑。參考文獻(xiàn)：1 武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心.綜合化學(xué)實(shí)驗(yàn)（第1版）M. 武漢：武漢大學(xué)出版社，2003，39-50。The centerof experiment of College of Chemistry and Molecular Science, Wuhan University, comprehensive chemical experiment,2003，39-50.Preparation and Purification of S