離子交換色譜在細(xì)菌素分離純化中的應(yīng)用

1、570文章編號:10052376X(2010)0620570203ChineseJournalofMicroecology,Jun12010,Vol122No16【綜述】離子交換色譜在細(xì)菌素分離純化中的應(yīng)用陸泉,施波,李瑞勝,蔡慶霞,陳曉琳,張明(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,安徽合肥230036)【摘要】近年來,乳酸菌細(xì)菌素在食品防腐劑和醫(yī)藥領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景,而細(xì)菌素的分離純化是其分子結(jié)構(gòu)及遺傳學(xué)特性等相關(guān)研究的重要基礎(chǔ)。離子交換色譜是細(xì)菌素分離純化的主要手段之一。本文闡述了離子交換色譜原理,分析了影響離子交換色譜分離純化細(xì)菌素的各種因素,探討了細(xì)菌素分離純化中離子交換色譜條件的選擇。【關(guān)

2、鍵詞】離子交換色譜;細(xì)菌素;分離純化【中圖分類號】Q93233【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】ATheapplicationofionexchangechromatographyforthepurificationofbacteriocinsLUQuan,SHIBo,LIRui2sheng,CAIQing2xia,CHENXiao2lin,ZHANGMing(CollegeofLifeScience,AnhuiAgricultureUniversity,Hefei230036,China)【Abstract】Duringthelastfewdecades,lacticacidbacteriabacterioci

3、nshavebeenwidelyexploredandinvestigatedasfoodpreservativesandpharmaceuticals.Andthehomogeneitybacteriocinsarenecessaryforthestudiesofbiochemicalandgeneticcharacterization.IonExchangeChromatography(IEC)isprobablythemostfrequentlyusedchromatographictechniqueforthepurificationofbacteriocins.Inthispaper

4、,theprinciplesofIEC,theeffectsofthevariousfactorsontheionexchangeprocess,andtheexperimentaldesignofIECforthepurificationofbacteriocinswerereviewed.【Keywords】IEC;Bacteriocin;Purification細(xì)菌素(bacteriocin)是某些細(xì)菌在代謝過程中通過核糖體合成的一類具有抑菌活性的多肽或蛋白質(zhì),主要抑制同種或親緣關(guān)系較近的細(xì)菌,1,2副作用,年,聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)/(WHO)聯(lián)合食品添加劑專家委員會(huì)確認(rèn)nis

5、in可作為高效安全的天然防腐劑使用3,現(xiàn)廣泛應(yīng)用于食品保鮮、醫(yī)療保健和獸醫(yī)飼料等領(lǐng)域4,5。在細(xì)菌素的理論和應(yīng)用研究中,細(xì)菌素的分離純化是其分子結(jié)構(gòu)及遺傳學(xué)特性等相關(guān)研究的重要基礎(chǔ)?；诩?xì)菌素所帶電荷及分子量大小等特征,可通過離子交換色譜、凝膠色譜、疏水作6用色譜和反相色譜等技術(shù)進(jìn)行分離純化。其中,離子交換色譜是根據(jù)各種蛋白質(zhì)所帶電荷的不同達(dá)到分離純化的目的,該方法具有操作方便、分辨率高、交換容量大等特點(diǎn),已成為蛋白質(zhì)分離純化中最常用的手段之一7,在細(xì)菌素的純化過程中離子交換色譜亦是主要的分離手段,如在細(xì)菌素Para28910cin1.7、UbericinA、mesenterocinE131、

6、curvaticin1112L442和carnocinKZ213等的純化過程中均使用了離子交換色譜。本文綜述了離子交換色譜的原理,細(xì)菌素分離純化中離子交換色譜條件的選擇,為其更好的應(yīng)用于細(xì)菌素的分離純化提供參考。1離子交換色譜簡介7,131.1離子交換色譜原理離子交換色譜(ionexchangechro2matography,IEC)是以離子交換劑為固定相,根據(jù)流動(dòng)相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)的結(jié)合力強(qiáng)【收稿日期】2010203217【基金項(xiàng)目】國家863計(jì)劃項(xiàng)目(2008AA10Z319);安徽省高?！笆晃濉眱?yōu)秀人才計(jì)劃(【教秘人】20042100)【作者簡介】陸泉(1

7、9832),男,碩士研究生,研究方向?yàn)槲⑸锷韺W(xué),Email:luquan;張明,通訊作者,Email:zhangming。1.2,。離子交換劑,稱為陽離子交換劑(cationexchanger),常見的功能基團(tuán)如磺丙基(sulfopropyl,SP)和羧甲基(carboxymethyl,CM)等;離子交換劑的功能基團(tuán)能與帶負(fù)電的離子基團(tuán)發(fā)生交換作用的,稱為陰離子交換劑(anionexchanger),常見的功能基團(tuán)如季銨基(quaternaryammonium,Q)和二乙基氨乙基(diethylaminoethyl2ene,DEAE)等。又根據(jù)功能基團(tuán)的解離性質(zhì),離子交換劑還可分為強(qiáng)離子交

8、換劑和弱離子交換劑;前者如磺丙基、季銨基,后者如羧甲基、二乙基氨乙基。離子交換劑的強(qiáng)弱并不是指蛋白質(zhì)與交換劑結(jié)合的牢固程度,而是取決于帶電功能基團(tuán)的酸離解常數(shù)pKa的大小。1.3離子交換色譜中的疏水作用和吸附作用7,14在離子交換色譜中,雖然蛋白質(zhì)與離子交換劑的結(jié)合以相反電荷之間的離子鍵為主,但實(shí)際上還存在疏水作用和吸附作用,這些作用對于物質(zhì)的保留有著一定的影響。離子交換過程中如果使用帶有非極性骨架的離子交換劑就會(huì)出現(xiàn)疏水作用,如離子交換樹脂。這類離子交換劑的非極性骨架帶有較強(qiáng)的疏水性,能與蛋白質(zhì)分子中的某些疏水性氨基酸殘基結(jié)合。在離子交換色譜柱的長期使用過程中,部分功能基團(tuán)可能會(huì)流失,暴露出

9、固定相的基質(zhì),此時(shí)溶質(zhì)離子易與固定相基質(zhì)發(fā)生吸附作用;或者,被測樣品中有的溶質(zhì)離子未被徹底洗脫,附著在固定相表面,導(dǎo)致溶質(zhì)離子有可能與色譜固定相上的污染物發(fā)生吸附作用。因此,離子交換色譜中的吸附作用與固定相的種類和結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。1.4離子交換色譜的保留機(jī)制15離子交換色譜對生物大分子的色譜保留行為是一個(gè)十分復(fù)雜的過程,這主要是因?yàn)樵诩?xì)菌素和酶等蛋白類物質(zhì)的分離過程中,除了靜電作用以外,還存在被分離物質(zhì)與離子交換劑表面的疏水作用和吸附作用等。對離子色譜保留機(jī)理的研究歷經(jīng)了很長一段時(shí)間,目前普遍認(rèn)可的可用于表征生物大分子色譜保留行為的模型是計(jì)量置換模型(stoichiometricdisplace

10、mentmodelforreten2中國微生態(tài)學(xué)雜志2010年6月第22卷第6期tion,SDM2R)。SDM2R模型從熱力學(xué)平衡常數(shù)出發(fā),描述體系中溶質(zhì)、流動(dòng)相和固定相分子間多種相互作用,進(jìn)而計(jì)算出組分間相互作用的定量關(guān)系及其量度的大小。SDM2R為我們571定范圍。文獻(xiàn)報(bào)道的多見于選擇比pI高12個(gè)pH單位811,1729,MOTTA等16選擇比pI低12個(gè)pH單位。對于分離自天然產(chǎn)物的細(xì)菌素來說,在分離純化的初期很可能對目的成分的性質(zhì)不清楚,此時(shí)對于起始緩沖液pH的確定可用試管法13。起始緩沖液的濃度一般比較低,介于1050912,18,2225,27298,17,19,21,26mmo

11、l/L,以20mmol/L、50mmol/L為主,10mmol/L16,20較少見。低濃度可以保證目的蛋白在吸附階段能夠結(jié)合到交換劑上,但過低的起始濃度有可能造成蛋白質(zhì)在離子交換劑上吸附過于牢固而增加洗脫的困難。2.3.3非緩沖鹽在流動(dòng)相中,非緩沖鹽的離子強(qiáng)度和pH一樣重要,這兩個(gè)因素共同控制著蛋白質(zhì)在離子交換色譜柱上的保留行為、分離度和回收率。在進(jìn)行色譜分離時(shí),使用不同的非緩沖鹽離子,可能造成不同物質(zhì)被洗脫的順序發(fā)生變化。在陽離子交換劑上,蛋白質(zhì)的保留值與無機(jī)鹽離子的關(guān)系為Ba2+<Ca2+<Mg2+<NH4+<K+<Na+<Li+;在陰離子交換劑上,它們

12、的關(guān)系為F-<Cl-<Br-<I-。細(xì)菌素純化中,選擇的鹽離子一般為置換能力居中的無機(jī)離子,例如+812,1629Na,在洗脫與交換劑結(jié)合牢固的蛋白質(zhì)時(shí),選用強(qiáng)的置換離子具有優(yōu)勢。對于特定的樣品來說,需要多大的離子強(qiáng)度才能將其從離子交換劑上洗脫下來,并沒有一個(gè)固定的規(guī)律,需要從實(shí)驗(yàn)中摸索。文獻(xiàn)報(bào)道的最大濃度有1.510,11,16mol/L、1.0mol/L8,17,18,20,24、0.6mol/L25、0.59,19,23,26,29mol/L。但有效的洗脫濃度各異,LacticinZ21、Lac2192210ticinQococcinQocinE131的有效洗脫度為5m

13、ol/L、0.75mol/L0.8。2.3.一般認(rèn)為理論塔板數(shù)在1.5ml/min以,在2.0ml/min以上的流速區(qū)無明顯的增加。增大流速會(huì)減小溶質(zhì)保留;減小流速可增加樣品各組分間的分離度,但是要考慮待測樣品的分離純化時(shí)間、活性、峰展寬和成本的影響,且只能在一定范圍內(nèi)減小流速。細(xì)菌素的純化中,洗脫階段的流速各異,有18,18,24,25,27,29ml/min、1.2ml/min28、2ml/min11,22、5917ml/min和10ml/min。2.4洗脫技術(shù)離子交換色譜洗脫時(shí),要想使樣品從離子交換劑上洗脫下來,可采用的方法有:(1)改變洗脫劑的pH:這是為了使蛋白質(zhì)分子帶電情況發(fā)生變化

14、,當(dāng)接近蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí),蛋白質(zhì)分子所帶凈電荷為零,從交換劑上解吸附并被洗脫下來;(2)增加洗脫劑的離子強(qiáng)度:蛋白質(zhì)與交換劑的帶電狀態(tài)均未改變,但無機(jī)離子與蛋白質(zhì)競爭結(jié)合交換劑,降低蛋白質(zhì)與交換劑的相互作用而被洗脫下來,此方法為純化細(xì)菌素過程中最常用的方法。根據(jù)洗脫劑發(fā)生改變時(shí),其pH或離子強(qiáng)度是否連續(xù),洗脫技術(shù)分為步進(jìn)式洗脫(stepwiseelution)和梯度洗脫(gradientelution)。細(xì)菌素純化中以離子強(qiáng)度梯度洗脫為主812,1620,2329,步進(jìn)式較少21,22。2.5樣品的預(yù)處理離子交換色譜要求樣品中必須無顆粒狀物質(zhì)存在,因而要對樣品進(jìn)行適當(dāng)處理。一般來說,所使用的分離

15、介質(zhì)顆粒越小,對樣品溶液的澄清度要求越高。在使用平均粒度在90m以上的介質(zhì)時(shí),使用孔徑為1m的濾膜進(jìn)行過濾就能夠達(dá)到要求;在使用平均粒度小于90m的介質(zhì)時(shí),應(yīng)使用孔徑為0.45m的濾膜進(jìn)行過濾;需要無菌過濾時(shí),可使用孔徑為0.22m的濾膜進(jìn)行過濾。當(dāng)樣品體積非常小或?yàn)V膜對目的蛋白有吸附作用時(shí),為了減少樣品的損失,7可選擇10000×g離心15min除去顆粒物。同時(shí)離子交換色譜進(jìn)行細(xì)菌素純化時(shí)要求低鹽濃度,而且要有合適的pH以保證細(xì)菌素表面有足夠的電荷與固定相表面發(fā)生相互作用,文獻(xiàn)報(bào)道的常用樣品處理方法為將待測樣品冷凍干燥后提供了一種可以利用離子交換色譜分離具有相似化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)的蛋

16、白質(zhì)的方法。2離子交換色譜分離純化細(xì)菌素的條件選擇影響離子交換色譜保留的因素有很多,如色譜柱的尺寸、流動(dòng)相種類、洗脫液濃度和流動(dòng)相流速等,這些是利用離子交換色譜分離純化細(xì)菌素的首要考慮因素,另外樣品中的物質(zhì)成分也將影響到分離效果,因而還要對樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚怼?.1色譜柱的尺寸色譜柱的尺寸通常用內(nèi)徑(mm)×高度(mm)來表示,其長度影響理論塔板數(shù)(即柱效)。離子交換色譜通常選用短的色譜柱,即高徑比小的色譜柱,典型的離子交換柱高度在50200mm。柱床過高,會(huì)導(dǎo)致區(qū)帶擴(kuò)散、洗脫峰變寬。但這不是絕對的,有文獻(xiàn)報(bào)道使用柱長為300mm的預(yù)裝柱有效地分離了細(xì)菌素mesenterocinE1

17、3110和curva211ticinL442。2.2離子交換劑選擇離子交換劑時(shí),主要依據(jù)分離的要求和目的樣品分子量的大小、等電點(diǎn)以及離子交換劑的有效交換容量等。在細(xì)菌素的分離純化過程中,離子交換色譜一般處于中間步驟,樣品達(dá)到了一定的純度,大多數(shù)雜質(zhì)已經(jīng)除去,此時(shí)應(yīng)當(dāng)選擇顆粒尺寸較大,具有大孔型結(jié)構(gòu),流速特性好的離子交換劑?；诖?細(xì)菌素的純化中大量使用瓊脂糖作為離子交換劑。這是一類在交聯(lián)瓊脂糖凝膠的基礎(chǔ)上連接功能基團(tuán)形成的離子交換劑,其孔徑大(90m),天然蛋白質(zhì)的分子量大小都低于它們的排阻極限。較少,MOTTA等16純化細(xì)菌素BLSP34交換劑DEAESepharoseFastSProseF

18、astFlowMFlow8,9次之。1012,這是一(1030m)而有一定的硬度,分辨率很高的離子交換劑。2.3流動(dòng)相離子交換色譜是利用不同物質(zhì)對固定相和流動(dòng)相的親和力不同而進(jìn)行分離的,流動(dòng)相的選擇同樣影響分離效果。流動(dòng)相分為兩種:一種是起始緩沖液,用于蛋白質(zhì)上樣并洗去不吸附的雜質(zhì);另一種是洗脫緩沖液,用于洗脫吸附在柱上的蛋白質(zhì),它是向起始緩沖液中添加非緩沖鹽得到的。非緩沖鹽的作用是提高離子強(qiáng)度從而使蛋白質(zhì)從交換劑上洗脫下來。2.3.1緩沖液的類型在離子交換過程中pH是否恒定直接影響到蛋白質(zhì)能否結(jié)合到交換劑上以及結(jié)合力的強(qiáng)弱。緩沖液的選擇遵循這樣一個(gè)原則:使用陽離子交換劑時(shí)選擇帶負(fù)電荷的緩沖離

19、子;使用陰離子交換劑時(shí)選擇帶正電荷的緩沖離子。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,在細(xì)菌素純化中多使用陽離子交換劑,緩沖液多為磷酸鹽緩沖液1012,1624和檸檬酸鹽緩沖液25,26;也有例外,HENG等9在純化UbericinA使用的是22嗎啡啉乙磺酸(22MES)。離子交換色譜可以除去很多的雜質(zhì),但經(jīng)過離子交換色譜得到的目的蛋白的洗脫峰中含有大量的緩沖物質(zhì)和鹽的成分,這些成分對于目的蛋白來說也是一種雜質(zhì),因此收集的樣品要經(jīng)過脫鹽或透析處理。使用揮發(fā)性的緩沖物質(zhì),就可以避免引入新的雜質(zhì),使得后期的處理較簡便,如乙酸銨緩沖液8,2729。2.3.2緩沖液的pH和濃度離子交換色譜中分離蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)是用pH來控制蛋白質(zhì)的

20、電荷。緩沖液的pH可以選擇在目的蛋白pI上下12個(gè)pH單位,這樣既能保證目的蛋白有充足的電荷結(jié)合到交換劑上,又不致于結(jié)合得過于牢固而難以洗脫。而pH的具體選擇應(yīng)取決于pI和蛋白質(zhì)的pH穩(wěn)572溶解于起始緩沖液中812,1623,2728或?qū)⒋郎y樣品溶液裝入透析袋中用起始緩沖液透析一定的時(shí)間2426,29,然后再過濾或離心處理。3離子交換色譜的應(yīng)用展望離子交換色譜具有很多優(yōu)點(diǎn),如:應(yīng)用靈活,可通過選擇不同的離子交換劑,控制緩沖液的pH和離子強(qiáng)度等條件優(yōu)化分離過程;商品化離子交換劑種類多,選擇余地大,價(jià)格也相對便宜等。離子交換色譜技術(shù)不僅在細(xì)菌素的分離純化中得到大量使用,而且被廣泛的應(yīng)用在生物化工

21、、制藥、環(huán)保以及食品等領(lǐng)域中。離子交換色譜已經(jīng)發(fā)展成為了分離和純化蛋白質(zhì)、核酸和其它帶電生物分子的主要手段之一?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1NETTLESCG,BAREFOOTSF.Biochemicalandgeneticcharacteris2ticsofbacteriocinoffood2associatedlacticacidbacteriaJ.JFoodProtect,1993,56(4):3382356.2KONISKYJ.ColicinsandotherbacteriocinswithestablishedmodeofactionJ.AnnRevMicrobiol,1982,36(1):125

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