蝎毒誘導(dǎo)紅藻氨酸癲癇大鼠海馬內(nèi)膽囊收縮素原mRNA的表達(dá)

1、蝎毒誘導(dǎo)紅藻氨酸癲癇大鼠海馬內(nèi)膽囊收縮素原mRNA的表達(dá) 摘要 目的和方法：本工作用紅藻氨酸（KA)癲癇模型，對用蝎毒處理該模型后海馬 內(nèi)膽囊收縮素原mRNA(PCCK mRNA)表達(dá)進(jìn)行原位雜交觀察，并對國產(chǎn)東亞鉗蝎粗毒抗癲癇反 復(fù)發(fā)作的機(jī)制做了初步探討。結(jié)果：原位雜交的實驗顯示，三周KA后，實驗 對照組與空白對照組相比，腹側(cè)海馬尤其是海馬門區(qū)PCCK mRNA陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯減少( P005)；實驗給藥組大鼠8例，其中有6例腹側(cè)海馬門區(qū)PCCK mRNA陽性神經(jīng)元數(shù)目有明 顯增加，顯著高于實驗對照組(P001)和空白對照組(P001)。結(jié)論： 蝎毒能選擇性地增加癲癇敏感大鼠腹側(cè)海馬PCC

2、K mRNA的表達(dá)。提示此效應(yīng)很可能是 蝎毒抗癲癇反復(fù)發(fā)作的重要的機(jī)制之一。關(guān)鍵詞：東亞鉗蝎粗毒；抗癲癇反復(fù)發(fā)作；紅藻氨酸； 腹側(cè)海馬 ； 膽囊收縮素原mRNA中國分類號：R338文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編 號：1000-6834（2000）02-0108-03EFFECT OF SCORPION VENOM ON THE EXPRESSION OF PCCK mRNA IN HIPPOCAMPUS OF EPILEPTIC RATS INDUCED BY KAINIC ACIDJIANG Chun-ling, PENG Yan, ZHANG Wan-qin(Department of Physio

3、logy, Dalian Medical University, Dalian 116027)ABSTRACTAim and Methods:In the present study, the effect of scorpion venom (SV) on the expression of PCCK mRNA in the ventral hippocampus of epileptic rats and its possible mechanisms was investigated by in situ, after SV or normal sali ne (NS) administ

4、rated for three weeks. Results: The number of PCCK m RNA positive neurons was markedly decreased in the ventral hippocampus, especi all y in hilus of KA+NS group as compared with NS+NS group. However, in six of eight SV treated group the number of PCCK mRNA positive neurons was significantly in crea

5、sed than that of KA+NS group and the NS+NS group. Conclusion: SV may selectively increase the expression of PCCK mRNA in the hippocampus of epil eptic susceptible rats. We postulate that this effect may be one of the importan t antiepileptic mechanisms of SV.KEY WORDS: scorpion venom;antiepileptic s

6、usceptibili ty;kainic acid;ventral hippocampus；PCCK mRNA據(jù)1997年報道，全世界有5千萬癲癇病人，其中2030轉(zhuǎn)為慢性或難治性癲癇1 。大量研究表明，一次急性癲癇發(fā)作后癲癇發(fā)作的敏感性形成，且長期存在，即反復(fù)出現(xiàn)癲 癇發(fā)作2，3。全蝎是中醫(yī)治療癲癇的首選藥物，其藥效在于蝎尾中的毒液組份一 蝎毒(scorpion venom，SV)。 現(xiàn)已從蝎毒中提取出具有抗癲癇作用的活性多肽4 。我們新近的工作證實蝎毒能明顯減輕癲癇大鼠癲癇發(fā)作的敏感性，能抑制一次急性癲癇 發(fā)作后海馬內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生，減輕神經(jīng)元受損的程度5。有關(guān)紅藻氨酸(ka ini

7、c acid,KA) 癲癇大鼠海馬內(nèi)膽囊收縮素(cholecystokinin，CCK)能神經(jīng)元的脫失及P CCK mRNA表達(dá)的變化已有研究7，8，但蝎毒對KA癲癇大鼠海馬內(nèi)CCK能中間神 經(jīng)元功能變化的影響尚未見報道。本文報道東亞鉗蝎粗毒(buthus martensii Karsch，BMK )增加癲癇大鼠海馬內(nèi)PCCK mRNA表達(dá)的原位雜交觀察結(jié)果，旨在探討蝎毒抗癲癇作用的可能 機(jī)制。1材料與方法11實驗分組和腦片制備選用健康雄性SD大鼠(體重180220 g)，自由進(jìn)食飲水，自然晝夜。一次性頸部皮下注 射驚厥劑量的KA(10 mg/kg)，誘發(fā)大鼠出現(xiàn)急性癲癇發(fā)作。癲癇發(fā)作行為的嚴(yán)

8、重程度按Raci ne所描述的15級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行觀察記錄。選用癲癇發(fā)作級別在4級以上的大鼠16只隨機(jī)均分成 兩組，即實驗給藥組(KASV)和實驗對照組(KANS)。分別用004的BMK蝎毒2 ml 和相同體積的生理鹽水(NS)灌胃，每日一次，連續(xù)三周。另選用12只大鼠隨機(jī)分成兩組，頸 部皮下注射生理鹽水(02 ml100 g)后，用相同劑量的蝎毒或生理鹽水灌胃做為空白給 藥組(NS+SV)和空白對照組(NS+NS)。三周后用4水合氯醛(400 mg/kg,i.p)麻醉：依次用0 01 mol/L PBS，4多聚甲醛+125戊二醛001 mol/L PBS經(jīng)心灌流:取腦；4多聚 甲醛后固定；再置入含

9、15蔗糖的磷酸鹽緩沖液中。用XY-86型振動切片機(jī)切取20 m厚海 馬冠狀腦片。12原位雜交實驗用與大鼠膽囊收縮素原有互補(bǔ)序列的24 mer的寡核苷酸(Rat-CCK-8)直接與信號酶( 堿性磷酸酶)相聯(lián)接。各組動物的海馬腦片在雜交液(26 ng探針ml雜交緩沖液)中于42下 孵育過夜，用2xSSC于42下漂洗15 min，用1xSSC室溫下漂洗腦片2次，每次10 min。分別 用緩沖液I(01 mol/L Tris-HCl0.15 mol/L NaCl，pH75)和緩沖液(01 mol/L Tris-HCl、01 mol/L NaCl、025 mol/L MgCl2，pH95)室溫下振動漂洗

10、腦片2 mi n，用顯色劑(NBT+X-磷酸鹽)顯色，甘油明膠封片，光鏡下觀察并攝片。13形態(tài)學(xué)的像分析和數(shù)據(jù)處理用LEICA Q 500 MC像分析儀進(jìn)行海馬腦片細(xì)胞計數(shù)。選實驗對照組(KA+NS)、實 驗給藥組 (KA+SV)、空白對照組(NS+NS)和空白給藥組(NS+SV)大鼠各6只，每個動物測3張腦 片。腦片的選定部位按George Paxinos & Charles Watson的大鼠腦譜確定前囪后580 m m，即海馬結(jié)構(gòu)所在部位。先在10物鏡下觀察腦片，選取腹側(cè)海馬門部位：然后在熒光屏 上畫出測量框的輪廓，測量框面積為6 1557 m2，寬度(W)和高度(H)分別為213 m

11、、289 m，計算測量框內(nèi)細(xì)胞個數(shù)。每個動物的3張腦片數(shù)值相加后取平均值，實驗數(shù)據(jù)均 用均數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)誤(s)表示，并輸入計算機(jī)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。四組 先 進(jìn)行方差分析，求得F值(P005)，然后每兩組之間再用q檢驗進(jìn)行比較。2結(jié)果空白對照組(NS+NS)大鼠的PCCK mRNA陽性神經(jīng)元散在分布于腹側(cè)海馬門區(qū)。與NS+NS組相比，KA后三周實驗對照組(KA+NS)大鼠的腹側(cè)海馬門區(qū)PCCK mRNA陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，幾乎完全消失(1A)(表1，P001)。實驗給藥組(KA+SV)大鼠(1B)，8例中有6 例腹側(cè)海馬門區(qū)PCCK mRNA陽性神經(jīng)元數(shù)目不僅未見減少，反而明顯增加，高于KA+NS

12、組(表 1，P001)和NS+NS組(表1，P0. 05,表1)。 Fig.1 PCCK mRNA positive neuron s in the ve-ntral hippocampus of epileptic rats treated with scorpion ve nom for three weeks(50) 空白給藥組(NS+SV)大鼠，與NS+NS組相比，腹側(cè)海馬門區(qū)PCCK mRNA陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯增加，以海馬門區(qū)密度最高，呈均勻分布(P001，表1)。Tab.1 Quantitative analysis of PCCK mRNA p ositive neurons i

13、n the ventral hippocampus of epileptic rats treated with scorpi on venom for three weeks (s，n=6)GroupNo of cellsNS+NS11.81.4NS+SV28.51.2*KA+NS2.70.7*KA+SV31.22.4*# *P0.01,vs NS+NS group,#P 0.01,vs KA+NS group 3討論KA癲癇模型是研究癲癇反復(fù)發(fā)作的理想動物模型,它具有短期急性發(fā)作和長期敏感性增強(qiáng)的特征。其長期效應(yīng)是指海馬門區(qū)脆弱敏感的含生長抑素(SS)、神經(jīng)肽Y(NPY)、膽囊收縮 素(C

14、CK)、-氨基丁酸(GABA)的抑制性中間神經(jīng)元的脫失，出現(xiàn)苔狀纖維發(fā)芽，對齒狀回 顆粒細(xì)胞起抑制作用的局部環(huán)路變成興奮性環(huán)路2,3。已證實CCK廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，是腦內(nèi)含量最高的神經(jīng)肽；在海馬，表達(dá)CCK的中間神經(jīng)元存在于齒狀回、海馬門區(qū)的輻射層和始層7,8。有文獻(xiàn)報告CCK-8肽 在某些癲癇模型中具有抗癲癇作用8,9，并能加強(qiáng)嗎啡的抗驚厥作用。我們新近 的工作證實KA癲癇大鼠經(jīng)蝎毒處置三周后，與KANS組相比，能明顯減輕癲癇的發(fā)作行為 10；本工作同時還觀察了蝎毒對KA癲癇大鼠海馬內(nèi)PCCK mRNA表達(dá)的影響。注 射KA三周后，癲癇大鼠腹側(cè)海馬門區(qū)PCCK mRNA陽性神經(jīng)元數(shù)目

15、明顯減少，表明癲癇發(fā)作后 腹側(cè)海馬門區(qū)PCCK mRNA表達(dá)的水平明顯降低，這與前人的報道是一致的。但我們還進(jìn)一步 觀察到癲癇大鼠用蝎毒處置后，腹側(cè)海馬門區(qū)PCCK mRNA陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯增加，表明蝎 毒能使腹側(cè)海馬門區(qū)PCCK mRNA表達(dá)的水平明顯增加。同時上述四組的硫堇染色結(jié)果與CCK原 位雜交結(jié)果的變化規(guī)律完全一致，即KASV組腹側(cè)海馬門區(qū)可被檢測的神經(jīng)元數(shù)目比KA NS組明顯增多，提示蝎毒也能減少腹側(cè)海馬門區(qū)表達(dá)CCK的抑制性中間神經(jīng)元的脫失。此外 ，我們還發(fā)現(xiàn)BMK蝎毒能選擇性地增加正常大鼠腹側(cè)海馬門區(qū)PCCK mRNA的表達(dá)，提示蝎 毒能加強(qiáng)生理性抗癲癇作用。根據(jù)本研究的結(jié)果

16、，我們推測蝎毒增加腹側(cè)海馬門區(qū)PCCK mRNA的表達(dá)，減少CCK能抑 制性中間神經(jīng)元的脫失，可能是其抗癲癇反復(fù)發(fā)作的重要的機(jī)制之一。至于其詳盡的機(jī)制還 有待于進(jìn)一步的研究。作者簡介：姜春玲（1963-），女，大連市人，副教授，碩士學(xué)位,博士 研究生，、現(xiàn)從事藥物抗癲癇敏感性的細(xì)胞分子機(jī)制的研究姜春玲(大連醫(yī)科大學(xué)生理教研室，大連116027)彭巖(大連醫(yī)科大學(xué)生理教研室，大連116027)張萬琴(大連醫(yī)科大學(xué)生理教研室，大連116027)參考文獻(xiàn)1 Loscher W G. Animals models of intractable epilepsy J. Prog Neurobiol,19

17、97,53:239-258.2 Hellier J L, Patrylo P R， Buckmaster P S, et al. Recurrent spontaneou s motor seizures after repeated low-dose systemic treatment with kainate: asses smen t of a rat model of temporal lobe epilepsy J. Epilepsy Res, 1998,31:73- 84.3Simpson T N, Zhang W Q, Bing C Y, et al. Kainic acid

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