紫杉醇對骨髓細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的巨噬細(xì)胞影響

1、紫杉醇對骨髓細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的巨噬細(xì)胞影響         11-01-30 10:47:00     編輯：studa20                   作者：李龍, 沈紅, 陳靜, 趙勇 【摘要】  目的: 研究紫杉醇對小鼠骨髓分化巨噬細(xì)胞的直接影響。方法: 常規(guī)方法無菌制備BA

2、LB/c小鼠骨髓細(xì)胞, 用含MCSF的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)7 d, 同時加入不同濃度紫杉醇, 通過流式細(xì)胞術(shù)對骨髓單核細(xì)胞分化的巨噬細(xì)胞的表型分子、 吞噬功能進(jìn)行測定, 采用遲發(fā)型過敏反應(yīng)（DTH）方法檢測巨噬細(xì)胞免疫原性。結(jié)果: 紫杉醇明顯降低骨髓單核細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞的數(shù)量; F4/80+巨噬細(xì)胞表面分子CD80、 CD14表達(dá)升高, 而IAd表達(dá)降低; 紫杉醇提高分化的巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的能力; 但使其免疫原性降低。結(jié)論: 紫杉醇能使骨髓單核細(xì)胞分化的巨噬細(xì)胞細(xì)胞吞噬能力提高, 但其免疫原性下降, 提示紫杉醇可能具有調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞免疫功能的作用。 【關(guān)鍵詞】  紫杉醇;

3、巨噬細(xì)胞; 吞噬紫杉醇最早是從北美短葉紅豆杉樹皮中分離得到的雙萜酰胺類化合物, 由于其具有獨(dú)特的抗癌活性而成為當(dāng)今抗癌藥物研究的熱點(diǎn)。紫杉醇抗癌作用一是誘導(dǎo)和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞微管蛋白聚合而不發(fā)生解聚, 使微管過于穩(wěn)定從而抑制紡錘體的形成, 致使染色體不能向兩極移動最終阻止有絲分裂的完成, 從而抑制腫瘤細(xì)胞生長; 二是紫杉醇調(diào)節(jié)多種凋亡相關(guān)的基因或蛋白, 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡1, 2; 三是紫杉醇激活巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO、 IL、 TNF等殺滅腫瘤細(xì)胞3。其他研究還表明, 紫杉醇具有LPS樣作用, 即紫杉醇能夠作用免疫細(xì)胞, 尤其是巨噬細(xì)胞, 下調(diào)巨噬細(xì)胞表面TNF受體的表達(dá), 誘導(dǎo)TNF的釋放, 也能促進(jìn)IL

4、1、 IFN和IFN的釋放。還有研究表明, 在大鼠的器官移植模型中, 紫杉醇能夠降低受者產(chǎn)生抗供者的細(xì)胞毒性抗體, 而且能降低細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性和IL2的產(chǎn)生, 結(jié)果提示在器官移植中紫杉醇可能有潛在的免疫抑制作用4。巨噬細(xì)胞是紫杉醇作用的主要效應(yīng)細(xì)胞, 研究紫杉醇對巨噬細(xì)胞分化能力的直接影響, 為紫杉醇作為免疫調(diào)節(jié)劑應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1  材料和方法11  材料  CO2培養(yǎng)箱為日本SANYO產(chǎn)品,  FASCalibur型流式細(xì)胞儀購自美國Becton Dickinson公司, 千分尺購自Brown & Sharpe公司, RPMI1640培

5、養(yǎng)基、  胎牛血清購自美國HyClone公司, MCSF、 紫杉醇抗FcR mAb（2.4G2, 移植生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備）和8.3 g/L紅細(xì)胞裂解液（TrisNH4Cl）購自Sigma公司, DMSO（Amresco,  ACS,  Grade）, 羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE;  Molecular Probes,  Inc. Eugene,  OR)。 PE標(biāo)記的抗小鼠F4/80 單克隆抗體（mAb）（BM8）, PE標(biāo)記的大鼠抗小鼠的IAd mAb (39108), FITC標(biāo)記的倉鼠抗小鼠的CD80 (B71) m

6、Ab (1610A1;  IgG2b), FITC標(biāo)記的大鼠抗小鼠的CD14 mAb (MP9;  IgG2b), FITC標(biāo)記的大鼠抗小鼠的CD11b mAb (M1/70;  IgG2b), 以上抗體均購自于BD Biosciences Pharmingen (San Diego,  CA)。SPF級68周齡雌性BALB/c小鼠和SPF級68周齡雌性C57BL/6小鼠均購于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。12  方法121  小鼠骨髓單核細(xì)胞的制備  取BALB/c小鼠頸椎脫臼致死。無菌剝?nèi)∶劰恰?股骨和髂骨, 剪去骨兩端,

7、 用RPMI1640沖洗骨髓腔得到骨髓細(xì)胞, 1 600 r/min, 離心6 min, 棄上清, 加入紅細(xì)胞裂解液消化紅細(xì)胞, 然后用RPMI1640培養(yǎng)液洗3次, 將分離得到的骨髓細(xì)胞加入培養(yǎng)皿中, 37、 50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。吸取未貼壁細(xì)胞, 1 600 r/min, 離心6 min, 細(xì)胞計數(shù), 調(diào)整細(xì)胞密度為1×109/L, 加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板, 然后向其加入含100 g/L MCSF的RPMI1640完全培養(yǎng)液, 37、  50 mL/L CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 d5。122  實(shí)驗(yàn)分組  分3組: MCSF組（100 g

8、/L）、 MCSF+紫杉醇（20 g/L）組和MCSF+DMSO（1  g/L）組, 每組設(shè)4個重復(fù)孔, 所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。123  流式細(xì)胞術(shù)檢測  收集誘導(dǎo)分化培養(yǎng)7 d的各組細(xì)胞于離心管內(nèi), 分別加入FACS緩沖液, 將細(xì)胞稀釋成調(diào)成4×109/L, 取100 L懸浮的細(xì)胞, 加2.4G2  10 L, 封閉細(xì)胞表面Fc受體。同時加入不同熒光標(biāo)記的抗體各10 L, 混勻, 4孵育30 min。加入FACS緩沖液, 1 600 r/min, 離心5 min, 洗去游離的熒光抗體, 重復(fù)2次。輕輕混勻懸浮細(xì)胞, 上流式細(xì)胞儀測定6。124&#

9、160; 巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的測定  巨噬細(xì)胞的收集: 收集誘導(dǎo)分化培養(yǎng)7 d的各組細(xì)胞, 用RPMI1640調(diào)細(xì)胞密度為2×108/L, 加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板, 培養(yǎng)2 h。CFSE標(biāo)記雞紅細(xì)胞: 雞翅采血, 制備新鮮雞紅細(xì)胞, PBS洗2次, 調(diào)整細(xì)胞密度為4×1010/L, 加入CFSE 5.0  mol/L,  37、 15 min, PBS洗2次, 調(diào)整CFSE標(biāo)記的細(xì)胞密度約為2×109/L, 然后將其加入到含有巨噬細(xì)胞的24孔培養(yǎng)板中, 37、  50 mL/L CO2培養(yǎng)箱共孵育2.5 h, 收集細(xì)胞, 上

10、流式細(xì)胞儀檢測。125  遲發(fā)型過敏反應(yīng)（DTH）  制備BALB/c小鼠脾細(xì)胞, 免疫C57BL/6小鼠, 10 d后取C57BL/6脾細(xì)胞, 調(diào)整細(xì)胞密度4×108/L, 作為刺激細(xì)胞。收集誘導(dǎo)分化7 d的巨噬細(xì)胞, 調(diào)整細(xì)胞密度為4×108/L, 作為反應(yīng)細(xì)胞。反應(yīng)細(xì)胞和刺激細(xì)胞11混合, 給正常C57BL/6小鼠耳朵皮層內(nèi)注射。用千分尺分別測量注射前和注射后24 h和48 h小鼠耳朵厚度7。126  統(tǒng)計學(xué)分析  實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都以x±s表示, 平均數(shù)間比較用t檢驗(yàn), 方差不齊時用t檢驗(yàn),  P<0.05差

11、異具有統(tǒng)計學(xué)意義。2  結(jié)果21  紫杉醇對誘導(dǎo)分化的巨噬細(xì)胞形態(tài)和分化的影響  用MCSF和加入不同濃度紫杉醇（5、 10、 15、 20g/L）的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)骨髓細(xì)胞7 d, 收集誘導(dǎo)分化的巨噬細(xì)胞, 對不同處理組的細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量進(jìn)行分析, 結(jié)果顯示, MCSF和DMSO組細(xì)胞形態(tài)沒有變化（圖1A）。不同濃度紫杉醇都能抑制骨髓細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞（圖1B）, 1020 g/L紫杉醇使骨髓細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯降低（P<0.05）。與對照組比較, 20 g/L紫杉醇處理骨髓細(xì)胞對誘導(dǎo)分化成的巨噬細(xì)胞表面的特異標(biāo)志物F4/80表達(dá)沒有影響,

12、各組巨噬細(xì)胞表面分子F4/80表達(dá)的陽性率接近100%（圖1C）。圖1  紫杉醇誘導(dǎo)分化的巨噬細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量的變化（略）Fig 1  The cell count and morphology of macrophages induced by paclitaxelA:  The morphology of macrophages in different treated groups; B:  The cell count of macrophages treated with paclitaxel;  C:  The identification of m