高效毛細(xì)管電泳法分析D苯丙氨酸與DN乙酰苯丙氨酸的對(duì)映

1、高效毛細(xì)管電泳法分析D苯丙氨酸與DN乙酰苯丙氨酸的對(duì)映體雜質(zhì)含量(1)】 目的：建立高效毛細(xì)管電泳法 (HPCE) 測(cè)定不對(duì)稱合成D苯丙氨酸和DN乙酰苯丙氨酸對(duì)映體雜質(zhì)含量的新方法. 方法：采用HPCE法對(duì)苯丙氨酸和N乙酰苯丙氨酸對(duì)映體的分離條件進(jìn)行優(yōu)化，并將該HPCE方法用于樣品測(cè)定. 結(jié)果：在40 mmol/L TrisH3PO4 (pH=2.5)，60 g/L SCD，-15 kV分離電壓，20柱溫的優(yōu)化條件下，苯丙氨酸和N乙酰苯丙氨酸對(duì)映體得到基線分離. 在藥物濃度為0.010.20 g/L的考察范圍內(nèi)，濃度和峰面積呈良好線性，L苯丙氨酸和LN乙酰苯丙氨酸的回歸方程分別為：Y=1065

2、.42X 31.02（R2=0.9989）和Y=996.02X 34.44（R2=0.9984），其中，Y為校正峰面積A/t，X為濃度（g/L）. 結(jié)論：該HPCE方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確，可用于苯丙氨酸和N乙酰苯丙氨酸對(duì)映體的手性拆分和對(duì)映體雜質(zhì)含量的測(cè)定. 【關(guān)鍵詞】 高效毛細(xì)管電泳；苯丙氨酸；N乙酰苯丙氨酸；手性分離；對(duì)映體雜質(zhì)0引言近年來(lái)，D苯丙氨酸（Dphenylalanin）作為藥物或藥物中間體已得到了廣泛的應(yīng)用1. 進(jìn)一步建立D苯丙氨酸及其重手性中間體DN乙酰苯丙氨酸對(duì)映體雜質(zhì)含量的測(cè)定方法對(duì)D苯丙氨酸生產(chǎn)質(zhì)量控制具有重的意義2-3. 我們利用高效毛細(xì)管電泳（HPCE）手性拆分具有簡(jiǎn)單、高

3、效、低消耗和符合綠色化學(xué)求的基本特性4-5，采用自制磺化環(huán)糊精為手性選擇劑分別建立同時(shí)適合于苯丙氨酸和N乙酰苯丙氨酸對(duì)映體的最佳分離條件，并測(cè)定這兩類物質(zhì)的一系列不同比旋光度樣品的對(duì)映體雜質(zhì)含量，以期發(fā)展一種簡(jiǎn)便分離該對(duì)映體及其對(duì)映體雜質(zhì)含量測(cè)定的毛細(xì)管電泳新方法.1材料和方法1.1材料P/ACETM MDQ型毛細(xì)管電泳儀系統(tǒng)（Beckman，USA），配有二極管陣列檢測(cè)器，Beckman System Gold軟件；320S pH計(jì)（Mettler Toledo Co.）；旋光儀（PerkinElmer 343, USA）. 自制磺化環(huán)糊精（sulfatedcyclodextrin，SCD）

4、由陜西師范大學(xué)化學(xué)系李保林教授惠贈(zèng)；其它試劑均為分析純. 對(duì)照品：光學(xué)純的D苯丙氨酸、外消旋苯丙氨酸（上海化學(xué)試劑二廠）；光學(xué)純的DN乙酰苯丙氨酸、外消旋N乙酰苯丙氨酸由本實(shí)驗(yàn)室合成（99.8% HPLC）.1.2方法1.2.1對(duì)照品和樣品溶液的制備L苯丙氨酸對(duì)照品溶液：精密配制1 g/L的D苯丙氨酸對(duì)照品溶液. 精密配置0.8 g/L的外消旋苯丙氨酸溶液（含L苯丙氨酸0.4 g/L）. 從中分別準(zhǔn)確吸取0.125, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 5.0, 6.0 mL置于10 mL容量瓶中，分別加入上述2.0 mL D苯丙氨酸對(duì)照品溶液，用水定容，則得在大量D苯丙氨酸存

5、在下的含L苯丙氨酸0.0050.24 g/L的一系列對(duì)照品溶液；L苯丙氨酸樣品溶液：精密稱取不同光學(xué)純度的D苯丙氨酸、DN乙酰苯丙氨酸分別配置成10.0 g/L的樣品母液，測(cè)定時(shí)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍適當(dāng)稀釋. LN乙酰苯丙氨酸溶液的配制同L苯丙氨酸.1.2.2電泳條件和實(shí)驗(yàn)方法未涂層石英毛細(xì)管柱（48.7 cm75 m, id，有效長(zhǎng)度38.5 cm，Beckman公司）. TrisH3PO4緩沖溶液中加入適量的SCD作為背景電解質(zhì)； 工作電壓-5-25 kV， 柱溫1520；0.5 psi壓力進(jìn)樣5 s；二極管陣列檢測(cè)；所用溶液均經(jīng)0.45 m纖維素酯膜過濾.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用線性回歸模型對(duì)濃

6、度與峰面積進(jìn)行線性關(guān)系分析.2結(jié)果2.1手性選擇劑濃度的選擇考察在3080 g/L濃度范圍的SCD對(duì)苯丙氨酸和N乙酰苯丙氨酸對(duì)映體分離的影響，結(jié)果60 g/L為SCD的理想濃度（圖1）.2.2背景緩沖液濃度與pH值對(duì)分離效果的影響40 mmol/L Tris濃度為同時(shí)適合于苯丙氨酸和N乙酰苯丙氨酸兩對(duì)對(duì)映體的理想分離條件(圖2). 通過對(duì)pH 1.54.0范圍內(nèi)苯丙氨酸和N乙酰苯丙氨酸對(duì)映體分離度的考察表明，苯丙氨酸對(duì)映體在pH 2.03.0的范圍內(nèi)都有良好分離，而只有在pH 2.5時(shí)才可使N乙酰苯丙氨酸對(duì)映體達(dá)到基線分離，所以選擇pH 2.5為分離酸度.2.3毛細(xì)管溫度對(duì)分離的影響在1530

7、的范圍內(nèi)， 溫度升高一方面使遷移時(shí)間縮短， 但同時(shí)也降低了對(duì)映體的分離度. 綜合考慮分離度與分析時(shí)間， 本實(shí)驗(yàn)選用20作為分離溫度， 在此溫度下， 兩對(duì)映體均可得到較好的分離結(jié)果與相對(duì)短的遷移時(shí)間.2.4樣品對(duì)映體雜質(zhì)含量的測(cè)定線性關(guān)系考察: 在0.010.20 g/L的濃度范圍內(nèi)， 按優(yōu)化的電泳條件分別對(duì)L苯丙氨酸或LN乙酰苯丙氨酸進(jìn)行線性關(guān)系分析， L苯丙氨酸的回歸方程為： Y=1065.42X 31.02 （R2=0.9989）； LN乙酰苯丙氨酸的回歸方程為： Y=996.02X 34.44 （R2=0.9984）， 其中， Y為校正峰面積（A/t）， X為濃度（g/L）. 回收率與最

8、低檢測(cè)限考察: 精密量取L苯丙氨酸或LN乙酰苯丙氨酸0.05, 0.10, 0.15 g/L的對(duì)照品溶液各4.0 mL（n=5）， 按上述電泳條件分析并計(jì)算回收率（%）. 結(jié)果L苯丙氨酸的回收率在99.1102.5 (n=5)； LN乙酰苯丙氨酸的回收率在98.1102.9. 同時(shí)， 按上述電泳條件電泳， 以信噪比S/N=3測(cè)定L苯丙氨酸和LN乙酰苯丙氨酸的最低檢測(cè)限（LOD）， 得到L苯丙氨酸的LOD為2.5 g/mL, LN乙酰苯丙氨酸的LOD為3.0 g/mL. 樣品測(cè)定: 對(duì)一系列具有不同比旋光度的D苯丙氨酸與DN乙酰苯丙氨酸合成樣品進(jìn)行了對(duì)映體雜質(zhì)含量的測(cè)定， 結(jié)果雜質(zhì)L苯丙氨酸的含

9、量在0.25%9.3%之間， 雜質(zhì)LN乙酰苯丙氨酸的含量在0.20%8.2%之間(圖3).3討論隨SCD手性選擇劑濃度的提高，苯丙氨酸和N乙酰苯丙氨酸對(duì)映體的分離度Rs均增大，當(dāng)手性選擇劑濃度提高到60 g/L時(shí)，苯丙氨酸和N乙酰苯丙氨酸兩對(duì)對(duì)映體的Rs值達(dá)到最大. 而進(jìn)一步提高手性選擇劑的濃度反而導(dǎo)致了分離度的下降，這和Williams等6提出的分離模型相一致，即存在一個(gè)最佳手性選擇劑濃度，濃度過高或過低，都會(huì)導(dǎo)致分離度的下降. 同時(shí)，當(dāng)SCD濃度超過70 g/L時(shí)，電流不穩(wěn)，基線漂移，這可能是由于SCD帶負(fù)電，濃度較大時(shí)，受電場(chǎng)力較大，電泳電流增大過多而導(dǎo)致焦耳熱較大所致. 而在60 g/

10、L時(shí)，N乙酰苯丙氨酸和苯丙氨酸對(duì)映體的分離度分別達(dá)到1.74和3.22，所以選擇60 g/L為SCD的理想濃度.【摘】目的：建立高效毛細(xì)管電泳法 (HPCE) 測(cè)定不對(duì)稱合成D苯丙氨酸和DN乙酰苯丙氨酸對(duì)映體雜質(zhì)含量的新 本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請(qǐng)不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系我們。緩沖溶液的濃度影響溶液的粘度系數(shù)、溶質(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)等，最終影響分析物的分辨率和遷移時(shí)間. 由圖2可見，苯丙氨酸對(duì)映體在3045 mmol/L的Tris濃度范圍內(nèi)均得到良好的分離（Rs2），但只有

11、在40 mmol/L才可使N乙酰苯丙氨酸達(dá)到基線分離（Rs=1.72）. 同時(shí)，隨Tris濃度的增加，兩對(duì)對(duì)映體的遷移時(shí)間也均增加，所以本實(shí)驗(yàn)選擇40 mmol/L Tris濃度為同時(shí)適合于苯丙氨酸和N乙酰苯丙氨酸兩對(duì)對(duì)映體的理想分離條件.本文建立了同時(shí)適合于苯丙氨酸和N乙酰苯丙氨酸對(duì)映體的HPCE分離條件，并用于該產(chǎn)品的對(duì)映體雜質(zhì)含量的分析，對(duì)于這兩類手性藥物或藥物中間體合成中光學(xué)純度控制具有重意義.【參考文獻(xiàn)】1Pogson CI, Knowles RG, Salter M. The control of aromatic amino acid catabolism and its rel

12、ationship to neurotransmitter amine synthesis J. Crit Rev Neurobiol, 1989, 5(1): 29-64.2Miyazaki T, Sugawara M, Danjo H, et al. Dihydroboronium derivatives of (S,S)1,2bis(tbutylmethylphosphino) ethane as convenient chiral ligand precursors J. Tetrahedron Lett, 2004, 45: 9341-9344.3Mikus P, Kaniansky

13、 D. Capillary zone electrophoresis monitoring of enantioselective hydrogenation of Nacyldehydroamino acids J. J Sep Sci, 2002, 25(14): 872-876.4Zhao Y, Yang XB, Jiang R, et al. Analysis of optical purity and impurity of synthetic Dphenylalanine products using sulphated cyclodextrin as chiral selector by the reversedpolarity capillary electrophoresis J. Chirality, 2006, 18 (2):84-90.5Fanali S. Stereoselective analysis of pharmaceutical compounds in biological fluids using capillary electrophoresisJ