13-生物藥物安全性評(píng)價(jià)

1、生物藥物安全性評(píng)價(jià)第一節(jié) 生物類藥物概述一、生物類藥物的概念和種類p 生物類藥物（biopharmaceutics或biopharmaceuticals）是利用生物體、生物組織或器官等成分，綜合運(yùn)用生物學(xué)、生物化學(xué)等學(xué)科的原理與方法制得的天然生物活性物質(zhì)以及人工合成或半合成的天然物質(zhì)類似物。p 生物藥物主要包括生化藥物（biochemical drugs）生物技術(shù)藥物（bio-technology drugs)、和生物制品（biological products)等。1、生化藥物：一般是系指從動(dòng)物、植物及微生物提取的，亦可用生物-化學(xué)半合成，或用現(xiàn)代生物技術(shù)制得的生命基本物質(zhì)，如氨基酸、多肽、

2、蛋白質(zhì)、酶、輔酶、多糖、核苷酸、脂和生物胺等，以及其衍生物、降解物及大分子的結(jié)構(gòu)修飾物等。2、生物技術(shù)藥物：是指生物來源的和使用生物工程技術(shù)制造的藥物，包括多肽、蛋白質(zhì)及其衍生物或由其組成的產(chǎn)品，如細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、單克隆抗體、重組DNA 蛋白疫苗及人組織提取的內(nèi)源性蛋白等。3、生物制品：是根據(jù)免疫學(xué)原理，用微生物（細(xì)菌、病毒、立克次氏體以及微生物的毒素等）、動(dòng)物的血液、組織制成的，用以預(yù)防、治療以及診斷人或動(dòng)物傳染病的一類藥品。包括： 治療用生物制品：抗體、DNA重組技術(shù)制品等。 預(yù)防用生物制品：疫苗。（一）治療用生物制品 1.未在國(guó)內(nèi)外上市銷售的生物制品。2.單克隆抗體。3.基因治療、體

3、細(xì)胞治療及其制品。4.變態(tài)反應(yīng)原制品。5.由人的、動(dòng)物的組織或者體液提取的，或者通過發(fā)酵制備的具有生物活性的多組份制品。6.由已上市銷售生物制品組成新的復(fù)方制品。7.已在國(guó)外上市銷售但尚未在國(guó)內(nèi)上市銷售的生物制品。8.含未經(jīng)批準(zhǔn)菌種制備的微生態(tài)制品。9.與已上市銷售制品結(jié)構(gòu)不完全相同且國(guó)內(nèi)外均未上市銷售的制品（包括氨基酸位點(diǎn)突變、缺失，因表達(dá)系統(tǒng)不同而產(chǎn)生、消除或者改變翻譯后修飾，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行化學(xué)修飾等）。10.與已上市銷售制品制備方法不同的制品（例如采用不同表達(dá)體系、宿主細(xì)胞等）。11.首次采用DNA重組技術(shù)制備的制品（例如以重組技術(shù)替代合成技術(shù)、生物組織提取或者發(fā)酵技術(shù)等）。12.國(guó)內(nèi)外尚未

4、上市銷售的由非注射途徑改為注射途徑給藥，或者由局部用藥改為全身給藥的制品。13.改變已上市銷售制品的劑型但不改變給藥途徑的生物制品。14.改變給藥途徑的生物制品（不包括上述12項(xiàng)）。15.已有國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)的生物制品。（二）預(yù)防用生物制品 1、未在國(guó)內(nèi)外上市銷售的疫苗。2、DNA疫苗。3、已上市銷售疫苗變更新的佐劑，偶合疫苗變更新的載體。4、由非純化或全細(xì)胞（細(xì)菌、病毒等）疫苗改為純化或組份疫苗。5、采用未經(jīng)國(guó)內(nèi)批準(zhǔn)的菌毒種生產(chǎn)的疫苗（流感疫苗、鉤端螺旋體疫苗等除外）。6、已在國(guó)外上市銷售但未在國(guó)內(nèi)上市銷售的疫苗。7、采用國(guó)內(nèi)已上市銷售的疫苗制備的結(jié)合疫苗或者聯(lián)合疫苗。8、與已上市銷售疫苗保護(hù)性

5、抗原譜不同的重組疫苗。9、更換其他已批準(zhǔn)表達(dá)體系或者已批準(zhǔn)細(xì)胞基質(zhì)生產(chǎn)的疫苗；采用新工藝制備并且實(shí)驗(yàn)室研究資料證明產(chǎn)品安全性和有效性明顯提高的疫苗。10、改變滅活劑（方法）或者脫毒劑（方法）的疫苗。11、改變給藥途徑的疫苗。12、改變國(guó)內(nèi)已上市銷售疫苗的劑型，但不改變給藥途徑的疫苗。13、改變免疫劑量或者免疫程序的疫苗。14、擴(kuò)大使用人群（增加年齡組）的疫苗。15、已有國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)的疫苗。二、生物醫(yī)藥的潛在危險(xiǎn)1、生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)化的潛在危險(xiǎn) 病原體及其代謝產(chǎn)物通過接觸，可能感染人或其他生物（生物安全性）； 產(chǎn)品對(duì)人或其他生物的致毒性、致敏性或其他尚不預(yù)知的生物學(xué)反應(yīng)（潛在致病性）； 小規(guī)模試驗(yàn)的

6、情況下原本是安全的供體、載體、受體等實(shí)驗(yàn)材料，在大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)完全有可能對(duì)人和其他生物及其生存環(huán)境的產(chǎn)生危害（生物安全性） ； 在短期研究和開發(fā)利用期間內(nèi)是安全的基因工程藥物，很可能在長(zhǎng)期使用后產(chǎn)生無法預(yù)料的危害（潛在致病性） 。2、重組DNA 試驗(yàn)過程中的隱患實(shí)驗(yàn)室重組DNA試驗(yàn)過程中的潛在危害: 病原體，特別是重組病原體對(duì)操作者所造成的污染。 病原體或帶有重組DNA的載體及受體，逃逸出實(shí)驗(yàn)室，對(duì)自然環(huán)境造成污染?；蛑亟M生物堂而皇之地進(jìn)入了大自然。如轉(zhuǎn)基因植物因花粉風(fēng)揚(yáng)或蟲媒所進(jìn)行的有性生殖過程擴(kuò)散，所導(dǎo)致的“基因漂散”。生物實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)生的廢棄DNA片段的排放例如：廢棄重組質(zhì)粒DNA熱處理效率

7、如何？ p 上海市科委與環(huán)保局2006的聯(lián)合調(diào)查顯示, 實(shí)驗(yàn)室的生物性廢水通常只經(jīng)過100煮沸3-5min后排放下水道，或無任何預(yù)處理措施而直接排放。p 2008一項(xiàng)研究已證實(shí), 目前常用的針對(duì)生物實(shí)驗(yàn)室廢水的100熱處理過程難以徹底消解、破壞水中廢棄的重組質(zhì)粒DNA。p 熱處理質(zhì)粒DNA 的降解半衰期約為2.7 - 4min，30min后仍存在一級(jí)結(jié)構(gòu)完整的質(zhì)粒，且仍有3%-5%的活性；即使熱處理60min 其仍具有一定的生物活性。3. 疫苗（vaccine）應(yīng)用的安全性問題 疫苗制品成分本身作為毒性物質(zhì)對(duì)機(jī)體的直接損傷。|疫苗的大分子性、酸堿度、滲透壓、所含的防腐劑，均可能引起不同程度的炎

8、癥反應(yīng)，產(chǎn)生一些對(duì)機(jī)體有損害的反應(yīng)。 誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)引起的與免疫相關(guān)的毒性。 疫苗及其污染物和殘余雜質(zhì)引起的毒性。 若疫苗載體在體內(nèi)變異，將威脅患者的生命。 其它未知的毒性 4. 基因治療的前景及其安全性問題基因治療（gene therapy）是指將外源正?；?qū)氚屑?xì)胞，用以糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和異常引起的疾病，以達(dá)到治療目的目前的基因療法是先從患者身上取出一些細(xì)胞，然后利用對(duì)人體無害的逆轉(zhuǎn)錄病毒當(dāng)載體，把正常的基因嫁接到病毒上，再用這些病毒去感染取出的人體細(xì)胞，把正?；虿暹M(jìn)細(xì)胞的染色體中，使人體細(xì)胞就可以“獲得”正常的基因表達(dá)。 隨機(jī)整合：可能誘發(fā)插入突變，激活癌基因。病毒重組：缺陷型逆轉(zhuǎn)

9、錄病毒通過重組獲得復(fù)制能力。案例（略）5. 生物醫(yī)藥對(duì)國(guó)際安全的威脅p 利用重組DNA技術(shù)可以使許多疫苗和抗菌素失去作用（新型、高效傳染性病毒，用毒素基因與流感病毒基因拼接的新生物毒素已能夠大量生產(chǎn) ）。p 基因治療技術(shù)有可能被濫用，比如用于去掉不想要的基因，加入想要的基因，即用于人種的改造等。三、生物類藥物不同于化學(xué)藥物之處（一）生物類藥物的藥學(xué)和藥動(dòng)學(xué)特點(diǎn)v 多為蛋白質(zhì)、多肽和核酸，使用劑量小，藥理活性高，毒性相對(duì)較低。v 穩(wěn)定性差，對(duì)熱、酸、堿、重金屬以及pH較敏感，極易失活。v 分子量大，還時(shí)常以多聚體形式存在，很難透過胃腸道粘膜的上皮細(xì)胞層，故口服吸收很少，不能口服給藥，一般只有注射

10、給藥，不方便長(zhǎng)期給藥的病人；v 體內(nèi)生物半衰期較短，從血中消除較快，因此在體內(nèi)的作用時(shí)間較短，沒有充分發(fā)揮其作用。（二）生物藥物的特殊性 1、結(jié)構(gòu)確證不完全性 生物技術(shù)藥物的活性主要取決于其氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)，但由于其一般分子量較大，空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜，現(xiàn)有的分析方法和手段并不能完全地確認(rèn)其化學(xué)結(jié)構(gòu)。合成多肽結(jié)構(gòu)確認(rèn)的內(nèi)容：p 氨基酸序列研究：說明氨基酸連接順序是否正確，常常用Edman降解（即測(cè)定N端氨基酸）、質(zhì)譜、核磁共振譜等方法。p 空間結(jié)構(gòu)研究 生物藥物原則要求空間結(jié)構(gòu)研究，特別是長(zhǎng)肽。如文獻(xiàn)或研究顯示，某多肽需要維持一定空間才有活性，則必須開展相應(yīng)的空間結(jié)構(gòu)研究。2、種屬特異性包括不同人

11、種之間的差異、人與動(dòng)物之間的差異。不同種屬的動(dòng)物的同類受體在結(jié)構(gòu)或功能上可能存在差異。因此生物藥物在不同種屬動(dòng)物，存在生物活性的差異，甚至不同的反應(yīng)。3、多功能性在同一生物體內(nèi)，生物技術(shù)藥物的受體可能廣泛分布，或者針對(duì)的是特定的細(xì)胞信號(hào)通路，從而可以產(chǎn)生廣泛的藥理活性和毒性作用。因此，應(yīng)用中應(yīng)考慮與其藥理學(xué)效應(yīng)相關(guān)的潛在危害。 例如某些生長(zhǎng)因子EGF、VEGF和NGF，除了促進(jìn)表皮、血管、神經(jīng)組織的生長(zhǎng)外，也是胚胎正常發(fā)育必不可少的。阻斷這些通路（如FGFR拮抗劑）即使未發(fā)現(xiàn)發(fā)育毒性，在理論上存在風(fēng)險(xiǎn)。4、免疫原性和免疫毒性 免疫原性：指藥物刺激機(jī)體形成特異性抗體或致敏淋巴細(xì)胞的性質(zhì)。免疫原性

12、是藥物本身具有的性質(zhì),有免疫原性不一定導(dǎo)致毒性，但可以影響對(duì)藥物毒性、毒代或藥效的客觀評(píng)價(jià)。 免疫毒性：指受試品引起免疫抑制（感染，腫瘤）或增強(qiáng)（過敏反應(yīng)）或自身免疫反應(yīng)。可能與藥理活性相關(guān)(如抗排斥藥物) 或不相關(guān)(如部分抗腫瘤藥物)。（1） 免疫原性的強(qiáng)弱是生物技術(shù)藥物開發(fā)的決定因素之一。治療用生物制品：評(píng)價(jià)其免疫原性，在于考察藥物的免疫原性對(duì)藥效和安全性評(píng)價(jià)可能的影響。 例如，抗藥物抗體可能會(huì)中和藥物的活性、影響藥物的清除、血漿半衰期和組織分布，改變藥效/藥動(dòng)學(xué)，使在非臨床研究中觀察到的效應(yīng)可能并非藥物真正的藥理和/或毒性反應(yīng)。預(yù)防用生物制品：評(píng)價(jià)其免疫原性，在于考察藥物的免疫原性強(qiáng)弱及

13、其免疫保護(hù)作用的關(guān)系。（2）免疫原性檢測(cè)對(duì)生物藥物至關(guān)重要。在非臨床研究中評(píng)價(jià)免疫原性，主要目的在于考察生物藥物的免疫原性強(qiáng)弱和免疫原性對(duì)安全性評(píng)價(jià)可能的影響。第二節(jié) 生物類藥物臨床前安全性評(píng)價(jià)要求(1) 急性毒性實(shí)驗(yàn)（單劑量）：原則上所有新的有效成分均應(yīng)實(shí)施該實(shí)驗(yàn)。原則上應(yīng)選擇兩種以上的動(dòng)物，重點(diǎn)為掌握中毒癥狀及隨時(shí)間推移的變化及劑量反應(yīng)關(guān)系，不一定要求測(cè)定LD50。(2) 慢性毒性實(shí)驗(yàn)（重復(fù)給藥）Ø 給藥周期至少要達(dá)到臨床擬給藥時(shí)間。Ø 給藥頻率應(yīng)等于或大于臨床給藥頻率，若臨床給藥頻率按半衰期決定，也應(yīng)根據(jù)半衰期進(jìn)行；Ø 由于溶解度、注射次數(shù)、最大臨床擬用劑量

14、的限制，通常不確定最大耐受劑量 ，最高劑量至少應(yīng)為最高臨床擬用劑量的10倍。(3) 生殖毒性實(shí)驗(yàn)：臨床上孕婦、妊娠及授乳期可能使用的藥品原則上應(yīng)實(shí)施該實(shí)驗(yàn)。(4) 致突變實(shí)驗(yàn)：w應(yīng)優(yōu)先考慮使用哺乳類細(xì)胞進(jìn)行致突變實(shí)驗(yàn)w已證明與人型在自然狀態(tài)下相同的單一多肽或蛋白質(zhì)及疫苗不一定要求該實(shí)驗(yàn)。由于生殖細(xì)胞和體細(xì)胞都可發(fā)生染色體畸變。因此，染色體畸變?cè)囼?yàn)可分別在這兩種細(xì)胞中進(jìn)行，一般以骨髓或外周血細(xì)胞代表體細(xì)胞，睪丸精原細(xì)胞代表生殖細(xì)胞。(5)致癌性實(shí)驗(yàn)：w一般標(biāo)準(zhǔn)的致癌性實(shí)驗(yàn)（2年的嚙齒動(dòng)物）對(duì)生物技術(shù)藥物不合適；鼓勵(lì)使用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。w對(duì)具有免疫抑制或促進(jìn)細(xì)胞增殖的生物藥物，應(yīng)關(guān)注其致癌性評(píng)價(jià)：

15、如注意反復(fù)給藥毒性中組織病理學(xué)檢查、體外細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)等。w如有疑問，可考慮進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的致癌實(shí)驗(yàn)（受試物在動(dòng)物身上應(yīng)有活性和無免疫原性）(6) 免疫原性實(shí)驗(yàn)重復(fù)給藥，必須檢查抗體是否產(chǎn)生以及形成抗體后對(duì)藥理效應(yīng)影響方面的分析。應(yīng)選擇不易產(chǎn)生抗體的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1）抗體的檢測(cè)及其判斷² 檢測(cè)是否有抗體產(chǎn)生，抗體的出現(xiàn)時(shí)間、出現(xiàn)抗體的動(dòng)物數(shù)、劑量關(guān)系、抗體滴度的動(dòng)態(tài)變化等。² 判斷產(chǎn)生的抗體是中和抗體還是非中和抗體，是否和毒性相關(guān)等。中和抗體（neutralizing antibody）：是指能中和抗原生物學(xué)活性的抗體。如rhbFGF連續(xù)給藥15d后,在大鼠的rhbFGF 3個(gè)

16、劑量組中均可檢測(cè)出抗rhbFGF抗體,這種抗體具有抑制rhbFGF促進(jìn)NIH3T3細(xì)胞增殖的作用。非中和抗體：在臨床上可能也具有意義,因?yàn)檫@些抗體可能會(huì)增強(qiáng)或減少藥物清除,從而改變藥物的半衰期、組織分布或某些靶器官暴露于藥物的時(shí)間,最終可能影響其體內(nèi)的活性和毒性。2）抗體產(chǎn)生的后果 中和抗體可能會(huì)中和（降低）藥物的活性； 中和抗體和非中和抗體均可能影響藥物的清除、血漿半衰期和組織分布； 中和抗體抑制內(nèi)源性蛋白，改變藥效/藥動(dòng)學(xué)，使在研究中觀察到的效應(yīng)可能并非藥物真正的藥理和/或毒性反應(yīng)。 注射部位出現(xiàn)局部反應(yīng)、或輕度及致命性全身反應(yīng)。(7)安全藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)常常與單次和多次給藥毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)合進(jìn)行；不

17、用嚙齒動(dòng)物；增加腎臟免疫復(fù)合物檢查。(8)毒代動(dòng)力學(xué)研究：同化學(xué)藥物(9)局部刺激實(shí)驗(yàn)：局部用藥品及血液制品均應(yīng)實(shí)施。（10）其他：如過敏性檢測(cè)第三節(jié) 生物藥物安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)關(guān)注問題（一） 生物藥物非臨床安全性評(píng)價(jià)考慮因素1、微生物學(xué)安全性1）外來感染源：細(xì)菌、支原體、真菌、病毒、克雅氏病原體等。2）轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品體內(nèi)重建為強(qiáng)復(fù)制型病毒載體的潛能。3）細(xì)胞攜帶同源性或異源性病毒，如逆轉(zhuǎn)綠病毒、EB病毒、巨細(xì)胞病毒在環(huán)境中擴(kuò)散的可能性，如病毒載體傳播。2、致癌性1）產(chǎn)品中殘留的致癌性DNA。2）轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的載體插入突變。3）細(xì)胞治療中供體的惡性或癌前細(xì)胞。4）細(xì)胞培養(yǎng)過程中導(dǎo)致永生化、惡性轉(zhuǎn)化和生長(zhǎng)

18、因子非依賴性5）細(xì)胞治療產(chǎn)品中的雜質(zhì)細(xì)胞。3、免疫學(xué)安全性1）抗藥性抗體。2）宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)（結(jié)構(gòu)差別）或雜質(zhì)。3）轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的病毒載體。4）細(xì)胞治療中的雜質(zhì)細(xì)胞。5）組織（器官類）產(chǎn)品的外源表位。6）DNA疫苗的免疫耐受性。4、藥理學(xué)安全性1）擴(kuò)大的藥理作用或意外的受體結(jié)合。2）分布于非靶組織3）細(xì)胞治療中細(xì)胞表型、功能和定位的改變。5、生物分布1）治療中所用基因及細(xì)胞的分布及體內(nèi)的滯留時(shí)間。2）轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品轉(zhuǎn)移至生殖細(xì)胞。3）轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的載體插入突變。4）載體播散及病毒傳播。5）產(chǎn)品（如生長(zhǎng)因子）活性或藥理作用、免疫調(diào)節(jié)活性。6、一般安全性問題1）蛋白質(zhì)、病毒載體的物理特征。2）共價(jià)結(jié)合性

19、配體分子，如毒素。3）產(chǎn)品配方及賦形劑。4）局部耐受性。（二）相關(guān)動(dòng)物的選擇p 一是指受試物可在此類動(dòng)物體內(nèi)，表現(xiàn)出藥理學(xué)活性。p 二是考慮受試物誘發(fā)動(dòng)物產(chǎn)生抗體的情況 rhbFGF在大鼠產(chǎn)生明顯的抗體，而在獼猴則不產(chǎn)生抗體。（bFGF在人與獼猴的氨基酸殘基同源性高達(dá)90%，而在人與大鼠之間的同源性僅為80%，所以抗體的產(chǎn)生似與該受試物在人與動(dòng)物之間種屬差異程度有關(guān)。）1、選擇相關(guān)種屬的動(dòng)物進(jìn)行毒性試驗(yàn)p 生物藥物的靶點(diǎn)主要是受體或抗原表位。所謂相關(guān)種屬，是指受試物在此類動(dòng)物體內(nèi)，由于受體/抗原決定簇(對(duì)單抗而言) 的表達(dá)，能產(chǎn)生藥理活性。p 選擇相關(guān)種屬的動(dòng)物進(jìn)行毒性試驗(yàn)，即選擇其藥理作用與

20、人體反應(yīng)一致、而抗體產(chǎn)生較少的動(dòng)物。2、通過體外試驗(yàn)來篩選生物技術(shù)藥物的相關(guān)動(dòng)物p 傳統(tǒng)的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)或BIAcore結(jié)合試驗(yàn)，可用來考察受試物與人體靶組織和不同試驗(yàn)動(dòng)物靶組織的結(jié)合情況。p 通過測(cè)定受體數(shù)量、受體親和力或藥理作用，幫助選擇合適的動(dòng)物種屬進(jìn)行體內(nèi)藥理和毒理試驗(yàn)。3、根據(jù)蛋白質(zhì)的同源性篩選相關(guān)動(dòng)物p 人源性重組多肽與動(dòng)物同類蛋白氨基酸序列的一致性常作為篩選相關(guān)動(dòng)物的依據(jù)。因動(dòng)物蛋白質(zhì)和人體蛋白質(zhì)氨基酸序列的同源性越高，人體蛋白質(zhì)越容易與動(dòng)物受體發(fā)生交叉反應(yīng)。p 蛋白質(zhì)同源性是篩選相關(guān)動(dòng)物的起點(diǎn)，但并不是作為確定相關(guān)動(dòng)物的絕對(duì)依據(jù)。 如IL-2和IL-6在動(dòng)物和人體內(nèi)的同源性很差，但重組人IL-2和IL-6卻在很多種試驗(yàn)動(dòng)物中顯示出藥理活性