川渝部分地區(qū)野生黃鱔RAPD引物篩選及其在綿陽群體的驗(yàn)證

1、第25卷 第4期 2010年12月 西 南 科 技 大 學(xué) 學(xué) 報(bào) JournalofSouthwestUniversityofScienceandTechnology Vo.l25No.4 Dec.2010川渝部分地區(qū)野生黃鱔RAPD引物篩選及其在綿陽群體的驗(yàn)證蔡 欣 張海容12(1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院 四川綿陽 621010;2.德州學(xué)院農(nóng)學(xué)系 山東德州 253023)摘要:采用RAPD技術(shù)對(duì)產(chǎn)自四川綿陽、內(nèi)江、雅安和重慶忠縣的24尾野生黃鱔基因組DNA進(jìn)行引物篩選,40條隨機(jī)引物中有4條引物擴(kuò)增出片段。選擇在4個(gè)地區(qū)黃鱔個(gè)體間多態(tài)性較豐富的RAPD引物A10在綿陽黃鱔群體進(jìn)行

2、擴(kuò)增分析。RAPD引物A10在6個(gè)綿陽黃鱔個(gè)體的擴(kuò)增,產(chǎn)生比較清晰的條帶并且呈現(xiàn)一定的多態(tài)性,綿陽黃鱔群體內(nèi)的平均遺傳相似率為0.8947,群體內(nèi)的平均遺傳距離為0.1053,從一定程度反映出綿陽地區(qū)黃鱔較低的遺傳多樣性。本研究所篩選引物可為黃鱔分子標(biāo)記和遺傳多樣性的分析、親緣關(guān)系和種質(zhì)的鑒定以及遺傳資源的保護(hù)利用提供參考。關(guān)鍵詞:野生黃鱔 RAPD 多態(tài)引物篩選中圖分類號(hào):Q75 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1671-8755(2010)04-0096-04ScreeningofRAPDpolymorphicPrimersforWildMonopterasalbusfromSomeRegion

3、sofSichuanandChongqingandVerificationinMianyangPopulationCAIXin,ZHANGHa-irong12(1.SchoolofLifeScienceandEngineering,SouthwestUniversityofScienceandTechnology,Mianyang621010,Sichuan,China;2.DepartmentofAgronomy,DezhouUniversity,Dezhou253023,Shandong,China)Abstract:RandomamplifiedpolymorphicDNA(RAPD)t

4、echniquewasemployedtoinvestigatethepoly-morphismsof24wildricefieldeelsfromMianyang,Neijiang,Ya-ancityandZhongxianCountyofChongqing.FortyRAPDprimerswereusedandonlyfourofthemwerefoundtoproduceDNAfragments.ThepolymorphicprimerSBS-A10wasusedtoamplifygenomicDNAofricefieldeelsfromMianyangandthestablypolym

5、orphicDNAfragmentswereobtained.TheaveragegeneticsimilarityandgeneticdistanceinMonopterasalbuspopulationfromMianyangwas0.8947and0.1053,respectively,whichmanifestedthelowergeneticdiversity.Therefore,thepolymorphicprimersscreenedinthisworkcouldbeusedtothestudyofinvestigatingthegeneticdiversity,phylogen

6、eticrelationshipsandgeneticresourceprotection.Keywords:WildMonopterasalbus;RAPD;Selectionofpolymorphicprimers黃鱔隸屬于合鰓魚目(SynbranchiForm),合鰓魚科(Sybranchidae),黃鱔屬(Monopterus)。黃鱔屬在全世界共有6個(gè)種,廣泛分布于亞洲東部及南部各國(guó),分布于我國(guó)的是M.albus。由于棲息地污染和過度捕撈,野生黃鱔資源急劇下降,因此,了解不同野生黃鱔種群以及群體內(nèi)個(gè)體間存在的遺傳變異,對(duì)保護(hù)我國(guó)的野 收稿日期:2010-04-27基金項(xiàng)目:西南科技大學(xué)

7、博士研究基金(編號(hào):06zx7121)資助。 作者簡(jiǎn)介:蔡欣(1972),男,博士,副教授,研究方向:動(dòng)物分子遺傳學(xué)。E-mai:lcaixin2323。第4期 蔡 欣,等:川渝部分地區(qū)野生黃鱔RAPD引物篩選及其在綿陽群體的驗(yàn)證97生黃鱔種質(zhì)資源的研究以及遺傳資源的保護(hù)具有現(xiàn)實(shí)意義。RAPD就是隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA,它以PCR為基礎(chǔ),利用人工合成的約10bp的隨機(jī)序列寡核苷酸作引物,以生物的基因組DNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,1產(chǎn)生不連續(xù)的DNA產(chǎn)物,通過瓊脂糖凝膠電泳來檢測(cè)DNA序列的多態(tài)性。RAPD標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單易行,擴(kuò)增的周期短,需要的DNA量少,無放射性;標(biāo)記數(shù)量多,可覆蓋基因組中

8、所有座位;合成的引物可用于任何生物基因組的分析,有商業(yè)化的成套引物試劑盒出售。因此,此種標(biāo)記已廣泛用于豬的種群分類鑒定、遺傳連鎖圖譜的建立、基因定位、雜種優(yōu)勢(shì)分析和標(biāo)記輔助選擇。目前利用分子標(biāo)記對(duì)黃鱔遺傳多樣性2的研究較少,賀順連等(2004)通過RAPD對(duì)3個(gè)黃鱔物種,即湖南沅江的M.albus,緬甸仰光的M.cuch-ia和印度尼西亞的M.fossorius,進(jìn)行遺傳多樣性分析,測(cè)到315個(gè)位點(diǎn),遺傳多樣性指數(shù)為0.1575,相似度系數(shù)為0.2879,表明3種黃鱔具有較高的遺傳變異。尹紹武等(2005)3采用RAPD標(biāo)記對(duì)采自湖南洞庭湖稻區(qū)的黃鱔野生群體和養(yǎng)殖群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步研究,用2

9、4個(gè)隨機(jī)引物在野生群體和養(yǎng)殖群體中分別擴(kuò)增出259和251條DNA片段,其中多態(tài)性片段數(shù)分別為116和92條,野生群體的多態(tài)性位點(diǎn)比例和雜合度明顯高于養(yǎng)殖群體。Caieta.l(2008)對(duì)四川3個(gè)地方(綿陽市、雅安市和內(nèi)江隆昌)以及重慶忠縣的野生黃鱔進(jìn)行了mtDNAD-loop部分序列遺傳多態(tài)性分析,發(fā)現(xiàn)所有59個(gè)個(gè)體的變異位點(diǎn)比較少,只定義了134個(gè)單倍型,所有個(gè)體類聚為一個(gè)單倍群,表現(xiàn)出單態(tài)性,說明這些地區(qū)黃鱔的遺傳多樣性比較低。本研究擬從四川野生黃鱔基因組篩選多態(tài)性RAPD引物,為野生黃鱔的資源管理和保護(hù)提供基礎(chǔ)資料和依據(jù),豐富野生黃鱔的遺傳多樣性研究?jī)?nèi)容。1 試驗(yàn)材料與方法1.1 實(shí)

10、驗(yàn)動(dòng)物與樣品采集從四川省綿陽市、雅安市、內(nèi)江隆昌縣以及重慶忠縣野外捕捉體形特征具有一定差異的野生黃鱔共24尾(表1),剪取尾巴約1cm的肌肉組織后放生,將采到組織裝入盛有75%的酒精的離心管后冷凍保存。1.2 特異引物設(shè)計(jì)所用RAPD隨機(jī)引物(SBS-A1SBS-A20,SBS-B1SBS-B20)全部購(gòu)自北京賽百盛生物技術(shù)有限公司。1.3 DNA的提取與PCR擴(kuò)增基因組DNA的提取按照Cai等的方法進(jìn)行,溶于TE緩沖液后取1LL通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR反應(yīng)總體系25LL,其中10PCR4表1 采樣地點(diǎn)和樣本情況Table1ListofMonopterusalbususedinthest

11、udy地 點(diǎn)四川綿陽市重慶忠縣四川雅安市四川內(nèi)江市Total群體名稱縮寫MCYN經(jīng)緯度104b77'E/31b47'N108b02'E/30b18N'102b97'E/29b97N'105b25'E/29b64'N樣本量1244424buffer2.5LL,dNTPs(10mmol/L)2LL,模板DNA(20ng/LL)2LL,RAPD引物各1LL,TaqDNA聚合酶(5U/LL)0.2LL,超純滅菌水17.3LL。PCR反應(yīng)條件:94e預(yù)熱變性7min,進(jìn)入循環(huán)程序;94e變性40s,35e退火1min,72e延伸1.5min

12、,共進(jìn)行40個(gè)循環(huán);最后72e延伸7min,終止于4e。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過1.4%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析。1.4 數(shù)據(jù)分析在數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)時(shí),僅記錄清晰且重復(fù)性好的DNA擴(kuò)增條帶。根據(jù)Lynch的方法計(jì)算黃鱔群體內(nèi)個(gè)體之間的遺傳相似率,公式如下:Sxy=2Nxy/(Nx+Ny),S=2SxyN5Sxy是兩個(gè)體間的遺傳相似率,Nxy表示個(gè)體x和y之間共有的DNA擴(kuò)增條帶數(shù),Nx和Ny分別是個(gè)體x和y的DNA擴(kuò)增條帶數(shù);S是群體內(nèi)的遺傳相似率,為群體內(nèi)所有兩個(gè)體間遺傳相似率的平均值。群體內(nèi)的遺傳距離D=1-S。98 西 南 科 技 大 學(xué) 學(xué) 報(bào) 第25卷 2 結(jié)果與分析2.1 基因組DNA提取從12尾

13、綿陽黃鱔肌肉組織提取的基因組DNA取樣1LL經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,發(fā)現(xiàn)除3號(hào)信號(hào)比較弱外,其余個(gè)體呈現(xiàn)亮度較高的條帶(圖1),提取效果比較理想,可以用于PCR擴(kuò)增分析。2.2 四川和重慶地區(qū)黃鱔RAPD引物的篩選從40條引物中篩選出4條能夠在12個(gè)樣本中擴(kuò)增出多條片段,且條帶清晰而穩(wěn)定,可用于其他樣本的基因組RAPD分析(圖2)。從圖2中可以看出,在引物A2擴(kuò)增產(chǎn)物中,重慶忠縣黃鱔、雅安黃鱔和綿陽黃鱔各一個(gè)個(gè)體具有多態(tài)性;在RAPD引物SBS-B18,重慶忠縣黃鱔、內(nèi)江黃鱔和雅安黃鱔各一個(gè)個(gè)體呈現(xiàn)出一定的多態(tài)性;在RAPD引物SBS-A12,重慶忠縣黃鱔、內(nèi)江黃鱔和雅安黃鱔各一個(gè)個(gè)體只

14、有一條擴(kuò)增條帶,因此不具有多態(tài)性;在RAPD引物A10,重慶忠縣黃鱔、內(nèi)江隆昌黃鱔和雅安黃鱔各一個(gè)個(gè)體也呈現(xiàn)出一定的多態(tài)性。2.3 綿陽黃鱔不同個(gè)體RAPD多態(tài)性分析為了驗(yàn)證上述RAPD引物在同一區(qū)域群體黃鱔中不同個(gè)體之間的遺傳多態(tài)性,選擇擴(kuò)增條帶較多、多態(tài)性在四個(gè)地區(qū)黃鱔個(gè)體間較豐富的RAPD引物SBS-A10在綿陽黃鱔群體進(jìn)行擴(kuò)增分析。結(jié)果顯示:不同黃鱔個(gè)體產(chǎn)生比較清晰的條帶,以及多態(tài)性DNA片段(圖3),6尾綿陽黃鱔個(gè)體擴(kuò)增的條帶數(shù)見表2。表2 RAPD引物A10的擴(kuò)增結(jié)果Table2TheresultofamplificationbyRAPDprimerSBS-A10引物A10序列(5

15、cy3c)GTGATCGCAG 擴(kuò)增條帶數(shù)及其個(gè)體數(shù)1 23143526根據(jù)SBS-A10在6個(gè)個(gè)體的擴(kuò)增條帶可以初步進(jìn)行群體內(nèi)個(gè)體之間遺傳關(guān)系的分析。利用公式Sxy=2Nxy/(Nx+Ny)計(jì)算綿陽黃鱔群體內(nèi)個(gè)體兩兩之間的遺傳相似率(表3),可以得到6個(gè)體之間遺傳相似率比較高,在0.751.00之間。綿陽黃鱔群體內(nèi)的平均遺傳相似率S=0.8947,群體內(nèi)的平均遺傳距離D=1-S=0.1053。3 討論,第4期 蔡 欣,等:川渝部分地區(qū)野生黃鱔RAPD引物篩選及其在綿陽群體的驗(yàn)證99方法所得遺傳標(biāo)記是基因表達(dá)的產(chǎn)物,在基因組DNA上的覆蓋面較窄,且受到發(fā)育階段和環(huán)境條件的影響,因而有其局限性。

16、DNA分子標(biāo)記所檢測(cè)的是基因組遺傳物質(zhì)的本身,不僅結(jié)果直接可靠,而且靈敏度高,大大提高了結(jié)果的可靠性。大量研究表明,RAPD分析具有簡(jiǎn)便、靈敏度高、不需要DNA的序列信息等,可以有效地檢測(cè)出種、品種及品系之間的遺傳多態(tài)性6-7。表3 綿陽黃鱔群體內(nèi)個(gè)體之間的遺傳關(guān)系Table3GeneticrelationshipbetweenMonopterasalbusindividualsfromMianyang個(gè)體M1M6M8M9M11M12M1444443M61.0044443M81.001.004443M90.890.890.89553M110.890.890.891.0053M120.860.8

17、60.860.750.753本研究采用RAPD技術(shù)對(duì)產(chǎn)自四川綿陽、內(nèi)江、雅安和重慶忠縣的野生黃鱔基因組DNA進(jìn)行引物篩選,40條隨機(jī)引物中只有4條引物擴(kuò)增出片段,而且其中SBS-A12在重慶忠縣黃鱔、內(nèi)江黃鱔和雅安黃鱔各一個(gè)個(gè)體只有一條擴(kuò)增條帶,擴(kuò)增條帶最多的SBS-A10也最多擴(kuò)增出7條帶,綿陽黃鱔群體內(nèi)的平均遺傳相似率為0.8947,群體內(nèi)的平均遺傳距離為0.1053,因此本研究結(jié)果從一個(gè)側(cè)面反映出這些地區(qū)野生黃鱔遺傳多樣性較低。RAPD引物SBS-A10在6個(gè)綿陽黃鱔 個(gè)體的擴(kuò)增,產(chǎn)生比較清晰的條帶并且呈現(xiàn)一定的多態(tài)性,從一定程度反映出綿陽地區(qū)黃鱔較低5注:對(duì)角線數(shù)據(jù)為各個(gè)個(gè)體的DNA擴(kuò)

18、增片段數(shù),下三角數(shù)據(jù)為不同個(gè)體之間共有的DNA擴(kuò)增片段數(shù),上三角數(shù)據(jù)為群體內(nèi)個(gè)體兩兩之間的遺傳相似率Sxy。的遺傳多樣性。此結(jié)果與Caietal(2008)通過mtDNAD-loop高變區(qū)測(cè)序分析的結(jié)果相似,四川地區(qū)野生黃鱔具有較低的遺傳多樣性。產(chǎn)生這一結(jié)果的原因,一方面可能由于綿陽乃至四川省境內(nèi)的野生黃鱔具有比較單一的類群,并且遺傳分化程度比較低,沒有與其他類群之間進(jìn)行過基因交流而遺傳多樣性比較貧乏;另一方面,可能與野生黃鱔的生態(tài)習(xí)性有關(guān),野生黃鱔屬于定居性種類,近親繁殖嚴(yán)重,經(jīng)過長(zhǎng)期的自然選擇之后,可能出現(xiàn)純度較高的個(gè)體。最后,由于本實(shí)驗(yàn)所選擴(kuò)增用多態(tài)引物數(shù)量有限,多態(tài)性不豐富,由此也可能導(dǎo)致研究群體遺傳多態(tài)性降低,因此需要篩選更多有效引物進(jìn)一步研究。魚類遺傳多樣性研究是評(píng)估魚類資源質(zhì)量和建立科學(xué)的魚類種質(zhì)資源管理規(guī)范的基礎(chǔ)。本研究中RAPD擴(kuò)增體系以及多態(tài)引物的篩選,對(duì)于進(jìn)一步研究四川乃至全國(guó)野生黃鱔群體的遺傳多樣性、群體結(jié)構(gòu)特征、遺傳分化程度建立了實(shí)驗(yàn)研究分析體系,并為進(jìn)一步探討野生黃鱔遺傳多樣性以及對(duì)遺傳資源的保