Site-Directed-Mutagenesis基因定點(diǎn)突變step-by-step-protocol

1、Site-Directed Mutagenesis本貼先講最簡單的一個點(diǎn)的定點(diǎn)突變技術(shù)，其它較長片段的突變，刪除，插入技術(shù)以后會慢慢奉上：在做實(shí)驗(yàn)之前，我們首先要搞清楚實(shí)驗(yàn)的目的和實(shí)驗(yàn)的原理。實(shí)驗(yàn)的目的應(yīng)該比較明確吧：就是要把自己的基因上面的一個堿基換成另外一個堿基。一般情況下我們會有幾種可能使我們需要這樣去做：第一：我們吊出來的基因有點(diǎn)突變，相信這可能是大家經(jīng)常會遇到的問題。基因好不容易吊出來，并裝進(jìn)了自己的載體，卻發(fā)現(xiàn)有一兩個堿基跟自己的預(yù)期序列或所有的公共數(shù)據(jù)庫不匹配，然后暴昏。大家實(shí)驗(yàn)室里面還是用Taq酶為主吧，Pfu這樣的高保真酶大家應(yīng)該用得不多吧，Taq酶的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)都很明顯：優(yōu)點(diǎn)

2、就是擴(kuò)增效能強(qiáng)，缺點(diǎn)就是保真性差，其錯配機(jī)率是比較高的，相關(guān)數(shù)字忘了，大家可以去網(wǎng)上查那個數(shù)字，不過感覺如果是2000bp的基因，如果擴(kuò)四五十個循環(huán)的話，很大機(jī)率會出現(xiàn)點(diǎn)突變，當(dāng)然這也跟具體PCR體系里的Buffer有很大關(guān)系，詳細(xì)情況這里就不討論了。第二：要研究基因的功能，在基因上自己選定位置更換堿基的保守序列，或者改造成不同的亞型，總之就是要人工改造堿基序列符合自己的實(shí)驗(yàn)需要，相信這也是那些研究基因的人經(jīng)常的一種思路吧。對于第一種情況：我們首先要分析出現(xiàn)堿基不匹配的位置是不是重要的位置，如果不是很重要，大可不必管它，比如說是三聯(lián)密碼子的最后一位，堿基的改變并沒有引起相應(yīng)氨基酸的改變，那么一

3、般情況下也可以不去理它。另外，在NCBI上人類的基因的版本一直在變化，也就是說同一個基因有不同的版本，或者稱不同的亞型，其堿基序列有些許的差異，只要自己克隆出來的堿基序列與其中一個相匹配，一般也就可以不做定點(diǎn)突變了。如果有時間沒錢，那干脆重新PCR然后再克隆進(jìn)自己的載體了，不過最好換個保真性好一點(diǎn)的酶如PFU，或者PCR循環(huán)數(shù)低一點(diǎn)，不過這些東西有時候也得靠運(yùn)氣啦。實(shí)在不行的話再來做定點(diǎn)突變。對于第二種情況：這種情況下一般也就只能做定點(diǎn)突變了。接下來開始聊一聊定點(diǎn)突變的原理吧，那個Stratagene試劑盒！上面有一個說明書，說得好像很正規(guī)，不過上面好多都是什么專利啊什么注意之類的話，看都不看

4、，我們簡明扼要地只講實(shí)驗(yàn)方面，通過設(shè)計(jì)引物，并利用PCR將模板擴(kuò)增出來，然后去掉模板，剩下來的就是我們的PCR產(chǎn)物，在PCR產(chǎn)物上就已經(jīng)把這個點(diǎn)變過來了，然后再轉(zhuǎn)化，篩選陽性克隆，再測序確定就行了。大家馬上就會想到幾個問題了：第一：引物怎么設(shè)計(jì)呢？第二：模板怎么去掉呢？第三：怎么拿到質(zhì)粒呢？對于第一個問題：怎么設(shè)計(jì)引物？我只能講一些原則，并舉一些例子。引物設(shè)計(jì)的原則其它貼子上都有講，這里就不重復(fù)了：不過這種突變引物要加上一個原則：一般都是以要突變的堿基為中心，加上兩邊的一段序列，兩邊長度至少為11-12base pair。若兩邊引物太短了，很可能會造成突變實(shí)驗(yàn)失敗，大家應(yīng)該都知道，引物至少要1

5、1-12個base pair才能與模板搭上，而這種突變PCR要求兩邊都能與引物搭上，所以兩邊最好各設(shè)至少12個base pair，并且合成多一條反向互補(bǔ)的引物。這么說大家可能不是很清楚，那我就舉個例子吧：X71661.1 TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 960現(xiàn)有序列 TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 924* *|-deletion X71661.1 AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCG

6、GAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT 1020現(xiàn)有序列 AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT 984*（上面為目的序列，下面為現(xiàn)有序列：我們發(fā)現(xiàn)有一個A堿基的缺失，其直接結(jié)果是在表達(dá)蛋白時后面的氨基酸全部錯配）我們以它為中心設(shè)計(jì)引物：兩邊各至少12個堿基，左邊由于含有較多的A造成引物GC%含量過低，故拉長引物使GC%含量不至過低，也使引物退火溫度升高。故合成引物CAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAGAAG并合成反向互補(bǔ)引物CTTCTGGAATTCCTCTTTT

7、TTTTTATCCAATTCTTGTTG其實(shí)也不一定要反向互補(bǔ)序列，只要反向引物也是兩邊都有大于12個堿基，同時符合引物設(shè)計(jì)的原則就行了。引物合成公司有很多家，大家可以去尋找，不同廠家的引物在價錢質(zhì)量上有一些差別，不過價錢一般都是一塊多一個堿基，合成時間約為一周。這樣的結(jié)果是PCR時把整個質(zhì)粒都給擴(kuò)出來了，得到的PCR產(chǎn)物是一條鏈完整，另一鏈有缺刻的PCR產(chǎn)物對于第二個問題：怎么去掉模板呢？再簡單的方法就是用DpnI酶，DpnI能夠識別甲基化位點(diǎn)并將其酶切，我們用的模板一般都是雙鏈超螺旋質(zhì)粒，從大腸桿菌里提出來的質(zhì)粒一般都被甲基化保護(hù)起來（除非你用的是甲基化缺陷型的菌株），而PCR產(chǎn)物都是沒有

8、甲基化的，所以DpnI酶能夠特異性地切割模板（質(zhì)粒）而不會影響PCR產(chǎn)物，從而去掉模板留下PCR產(chǎn)物，所以提質(zhì)粒時那些菌株一定不能是甲基化缺陷株，不會那么湊巧吧，哈哈。關(guān)于第三個問題：直接把通過DpnI處理的PCR產(chǎn)物拿去做轉(zhuǎn)化就行了，呵呵，然后再篩選出陽性克隆，并提出質(zhì)粒，拿去測序（這個就不用我多說了吧），驗(yàn)證突變結(jié)果，一般都沒問題的啦，我做了幾十個突變了，到目前為止還沒有做不出來的，呵呵，不要砸我啊。下面講一下具體的實(shí)驗(yàn)步驟以及一些實(shí)驗(yàn)中要注意的事情：1、 根據(jù)現(xiàn)有基因設(shè)計(jì)引物；2、 合成引物并準(zhǔn)備好模板；3、 PCR，4、 DpnI處理酶切產(chǎn)物；5、 轉(zhuǎn)化酶切產(chǎn)物；6、 篩選 陽性克??；

9、7、 送測序并測全長。最后就是慶祝啦，呵呵，沒什么復(fù)雜的。引物和質(zhì)粒都準(zhǔn)備好后，當(dāng)然就是做PCR嘍，不過對于PCR的酶和buffer，不能用平時的，我們做PCR把整個質(zhì)粒擴(kuò)出來，延伸長度達(dá)到幾個K，所以要用那些GC buffer或擴(kuò)增長片段的buffer，另外，要用保真性能較好的PFU酶來擴(kuò)增，防止引進(jìn)新的突變。那種Quick change試劑盒分為幾種不同的類型什么QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)突變試劑盒 、QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit長模板單點(diǎn)突變試劑盒（8kb）從原理上是一樣

10、的，只是PCR的酶和BUFFER不一樣，后面用了比較適合長片段擴(kuò)增的酶和BUFFER罷了，沒什么特別的東西。另外，DpnI處理的時間最好長一點(diǎn)，最少一個小時吧，最好能有兩三個小時，因?yàn)槿绻０逄幚淼貌桓蓛?，哪怕只有那么一點(diǎn)點(diǎn)，模板直接在平板上長出來，就會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。實(shí)驗(yàn)板長出來的菌有兩種可能 一種是質(zhì)粒DPNI沒處理干凈長出來的（模板），一種是PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化出來的 （突變體）不過這兩種菌長得一模一樣_，即使提出質(zhì)粒來也是一樣（酶切和PCR都無法區(qū)分），除了測序，是分不出來的， 做PCR時也最好做一個負(fù)對照（不加引物），實(shí)驗(yàn)管由于PCR時有引物，所以在DNPI處理前里面既含有模板又含有PCR產(chǎn)

11、物，而對照管由于PCR時沒放引物，所以在DPNI處理前里面只有模板。 如果兩者都拿去DNPI處理 就能夠證明模板已經(jīng)被去除干凈。若實(shí)驗(yàn)順利的話應(yīng)該是：正對照長菌負(fù)對照不長菌。如果出現(xiàn)正負(fù)對照都長菌，那么就是DpnI沒處理好，如果正負(fù)對照都不長菌，那么有兩種可能，一種是PCR陰性，也就是說PCR出問題了，另外一個可能就是轉(zhuǎn)化出問題了。要搞清楚是哪個問題，跑膠說明不了問題，那就做個轉(zhuǎn)化的對照，拿試劑盒的對照實(shí)驗(yàn)去試感受態(tài)，馬上就能知道轉(zhuǎn)化有沒問題。如果正對照很多菌，負(fù)對照有幾個菌，那么就是DPNI處理得不干凈，這個時候就得靠運(yùn)氣了_Site Directed Mutagenesis- (Kunke

12、l Method)1. Phosphorylate mutagenic oligonucleotide.6 uL Primer 10 pmoles (=100 ng for 33mer)/uL1 uL 20 mM ATP1 uL 10X T4 Kinase buffer2 uL T4 Kinase (20 units)Incubate at 37oC for 45 min.2. Second strand synthesis.Annealing X uL Uridine containing ssDNA (1 ug)2 uL phosphorylated primer (120 ng)1 uL

13、 10X annealing bufferH2O to 10 uLHeat to 95oC for 3 - 5 minutes, cool to 4oC slowly over 20 - 30 minutes.Centrifuge briefly to bring contents to bottom of tube. Place on ice.To the annealed template-primer, add: 4.2 uL 5X synthesis buffer1 uL 20 mM ATP2 uL T4 DNA polymerase (5 units)4 uL T4 DNA ligase (4 units)Incubate on ice for 5 min., at room temp for 5 min., then at 37oC overnight.If impatient, 5 uL may be removed after 2 hours and used fortransformation. Otherwise,transform5 uL into an appropriate strain (ung+) after the overnight incubation.10X T4 K