RNAi 技術(shù)原理精品課件

1、2021/8/23 最新 PPT 1RNAi的實(shí)驗(yàn)方法2021/8/23 最新 PPT 2目錄 miRNA的原理及機(jī)制 RNAi的機(jī)制及與miRNA的關(guān)系 RNAi實(shí)驗(yàn)的三大基本路線 RNAi機(jī)制的缺陷2021/8/23 最新 PPT 3miRNA的原理 MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小長(zhǎng)約2025個(gè)核苷酸。成熟的miRNAs是由較長(zhǎng)的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過(guò)一系列核酸酶的剪切加工而產(chǎn)生的，隨后組裝進(jìn)RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC），通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式識(shí)別靶mRNA，并根據(jù)互補(bǔ)程度的不同指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRN

2、A的翻譯。最近的研究表明miRNA參與各種各樣的調(diào)節(jié)途徑，包括發(fā)育、病毒防御、造血過(guò)程、器官形成、細(xì)胞增殖和凋亡、脂肪代謝等等。2021/8/23 最新 PPT 4miRNA如何行使功能？與mRNA的3端非編碼區(qū)特定位點(diǎn)(其第28個(gè)核苷酸)綁定：與mRNA完全互補(bǔ)時(shí)會(huì)引發(fā)mRNA降降解解；不完全的與mRNA配對(duì)時(shí)，會(huì)引發(fā)轉(zhuǎn)錄后的基因沉默基因沉默（抑制抑制靶基因的表達(dá)表達(dá)）從而抑制或阻止相應(yīng)的mRNA翻譯過(guò)程。2021/8/23 最新 PPT 5miRNA途徑：miRNA可以降解mRNA，或者抑制mRNA翻譯蛋白質(zhì)RNAi借用了天然的miRNA作用途徑2021/8/23 最新 PPT 6RNAi

3、作用機(jī)制2021/8/23 最新 PPT 7RNAi實(shí)驗(yàn)三大基本路線2021/8/23 最新 PPT 8線路一：非哺乳動(dòng)物細(xì)胞體系的RNAi實(shí)驗(yàn)和選擇 比如果蠅，線蟲(chóng)，擬南芥等低等生物和植物，由于不涉及抗病毒免疫應(yīng)答反應(yīng)，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄即可制備目標(biāo)基因的dsRNA（200bp左右），直接用長(zhǎng)雙鏈RNA進(jìn)行RNAi實(shí)驗(yàn)。2021/8/23 最新 PPT 9（1）構(gòu)建目的基因載體，選取目的基因的特異性序列（約200bp300bp），構(gòu)建到T載體上。 （2）使用5端連接有T7啟動(dòng)子的引物PCR擴(kuò)增目的基因，得到兩端均連接有T7啟動(dòng)子 序列的目的基因片段。（3）T7RNA聚合酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。dsRNA、ss

4、RNA、DNA模板。（4）加入Rnase 和Dnase消除ssRNA和DNA模板。（5）離心純化dsRNA。2021/8/23 最新 PPT 102021/8/23 最新 PPT 11siRNA導(dǎo)入細(xì)胞的方法對(duì)于線蟲(chóng)而言，2021/8/23 最新 PPT 12線路二：哺乳動(dòng)物細(xì)胞RNAi實(shí)驗(yàn)：siRNA的設(shè)計(jì)，合成哺乳動(dòng)物細(xì)胞導(dǎo)入30bp以上的長(zhǎng)雙鏈RNA（dsRNA），往往會(huì)誘發(fā)非預(yù)期的抗病毒應(yīng)答反應(yīng)，所以不能用體外合成的dsRNA直接導(dǎo)入細(xì)胞，常見(jiàn)的做法之一是直接制備1927bp左右的siRNA，然后再將siRNA轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞。2021/8/23 最新 PPT 13siRNA的轉(zhuǎn)染 哺

5、乳動(dòng)物轉(zhuǎn)染的常見(jiàn)方法有：磷酸鈣共沉淀、電穿孔法、機(jī)械法（例如,顯微注射和基因槍?zhuān)㈥?yáng)離子脂質(zhì)體試劑，其中陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑轉(zhuǎn)染法是目前最常用的轉(zhuǎn)染方法。2021/8/23 最新 PPT 14siRNA的轉(zhuǎn)染 有些研究人員發(fā)現(xiàn)，攜帶siRNA的脂蛋白納米顆粒通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，一旦納米顆粒進(jìn)入細(xì)胞，就會(huì)被捕獲在小泡中，這阻礙了大部分siRNA接近位于細(xì)胞質(zhì)的目標(biāo)mRNA。甚至?xí)谝恍r(shí)內(nèi)將其分解并排出細(xì)胞。2021/8/23 最新 PPT 15siRNA的轉(zhuǎn)染 研究顯示，在納米顆粒的再利用過(guò)程中，蛋白NPC1 是一個(gè)主要因子。沒(méi)有這一蛋白，納米顆粒就不會(huì)被細(xì)胞排出，讓siRNA有更多的時(shí)間去結(jié)合

6、目標(biāo)mRNA。NPC1缺乏時(shí)會(huì)出現(xiàn)交通擁堵，這樣siRNA就有更多的時(shí)間逃逸出來(lái)，但也會(huì)影響細(xì)胞的其他生理活動(dòng)，所以現(xiàn)在大部分研究人員都在通過(guò)改進(jìn)脂蛋白納米顆粒的結(jié)構(gòu)，來(lái)增強(qiáng)siRNA的轉(zhuǎn)染效率。2021/8/23 最新 PPT 16線路三：shRNA 表達(dá)載體和病毒載體 這類(lèi)載體都包含有一個(gè)RNA聚合酶 啟動(dòng)子和一個(gè)45個(gè)連續(xù)的T構(gòu)成的轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)以及選擇標(biāo)記，選用Pol 啟動(dòng)子是因?yàn)榇藛?dòng)子總是在距其一定距離的位置起始轉(zhuǎn)錄，而遇到45個(gè)連續(xù)的T就終止轉(zhuǎn)錄，并且終止于轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)第二個(gè)堿基處，十分精確。2021/8/23 最新 PPT 17 此法需首先化學(xué)合成一段編碼siRNA 正義和反義鏈

7、的模板，正義與反義序列之間由一段環(huán)(1oop)序列隔開(kāi)。插入載體Pol 啟動(dòng)子下游，然后轉(zhuǎn)入細(xì)胞，環(huán)序列可使轉(zhuǎn)錄出的RNA鏈折疊成具發(fā)夾結(jié)構(gòu)的小RNA分子（shRNA） ，這些小RNA可被細(xì)胞內(nèi)的Dicer切割為長(zhǎng)21bp的siRNA。2021/8/23 最新 PPT 182021/8/23 最新 PPT 19 RNAi作為一種重要的基因轉(zhuǎn)錄后沉默機(jī)制，廣泛應(yīng)用于基因功能研究，腫瘤及病毒感染性疾病治療的實(shí)驗(yàn)研究，其核心內(nèi)容是siRNA能夠抑制同源基因的表達(dá)。對(duì)于siRNA 而言，現(xiàn)在頗有爭(zhēng)議的地方在于它對(duì)靶基因的沉默特異性，主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面：（1）脫靶效應(yīng)。（2）打破內(nèi)源性miRNA的平衡。

8、RNAi機(jī)制的缺陷2021/8/23 最新 PPT 20脫靶效應(yīng) 即siRNA 對(duì)靶基因的沉默并不一定嚴(yán)格按照序列特異性方式進(jìn)行。（1）對(duì)于21-23nt 的siRNA，只需少至7nt 的序列與mRNA 同源，均可導(dǎo)致該基因的沉默。（2）誘導(dǎo)機(jī)體或細(xì)胞產(chǎn)生天然或獲得性免疫應(yīng)答，被一些蛋白酶降解，從而降低siRNA 對(duì)靶基因的特異性。2021/8/23 最新 PPT 21降低siRNA 脫靶效應(yīng)（1）要減少脫靶效應(yīng)，可以將針對(duì)同一mRNA的不同siRNA混合起來(lái)使用。這些siRNA作用于同一個(gè)目標(biāo)，每種siRNA的濃度得以降低，稀釋了各自的脫靶效應(yīng)，但不損害靶的特異性敲除。2021/8/23 最

9、新 PPT 22（2）對(duì)siRNA的化學(xué)修飾siRNA的化學(xué)修飾主要有三類(lèi)：磷酸骨架修飾（如硫代修飾，增強(qiáng)抵抗核酸酶的作用）;核糖修飾（如2- O- 甲基化，延長(zhǎng)基因沉默的時(shí)間） ;堿基修飾（ 如5- 溴- 尿嘧啶，增強(qiáng)堿基間的相互配對(duì)）。這幾種修飾主要是維持siRNA的穩(wěn)定性。2021/8/23 最新 PPT 23（3）優(yōu)化siRNA設(shè)計(jì)2021/8/23 最新 PPT 242021/8/23 最新 PPT 259、 人的價(jià)值，在招收誘惑的一瞬間被決定。22.2.822.2.8Tuesday, February 08, 202210、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。*2/8/2022 11:10

10、:09 PM11、人總是珍惜為得到。22.2.8*Feb-228-Feb-2212、人亂于心，不寬余請(qǐng)。*Tuesday, February 08, 202213、生氣是拿別人做錯(cuò)的事來(lái)懲罰自己。22.2.822.2.8*February 8, 202214、抱最大的希望，作最大的努力。2022年2月8日星期二*22.2.815、一個(gè)人炫耀什么，說(shuō)明他內(nèi)心缺少什么。2022年2月*22.2.8*February 8, 202216、業(yè)余生活要有意義，不要越軌。*2/8/202217、一個(gè)人即使已登上頂峰，也仍要自強(qiáng)不息。*22.2.8謝謝大家謝謝大家2021/8/23 最新 PPT 269、

11、人的價(jià)值，在招收誘惑的一瞬間被決定。22.2.822.2.8Tuesday, February 08, 202210、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。*2/8/2022 11:10:09 PM11、人總是珍惜為得到。22.2.8*Feb-228-Feb-2212、人亂于心，不寬余請(qǐng)。*Tuesday, February 08, 202213、生氣是拿別人做錯(cuò)的事來(lái)懲罰自己。22.2.822.2.8*February 8, 202214、抱最大的希望，作最大的努力。2022年2月8日星期二*22.2.815、一個(gè)人炫耀什么，說(shuō)明他內(nèi)心缺少什么。2022年2月*22.2.8*February 8, 202216、業(yè)余生活要有意義，不要越軌。*2/8/202217、一個(gè)人即使已登上頂峰，也仍要自強(qiáng)不息。*22.2.8謝謝大家謝謝大家2021/8/23279、 人的價(jià)值，在招收誘惑的一瞬間被決定。22.2.822.2.8Tuesday, February 08, 202210、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。*2/8/2022 11:10:09 PM11、人總是珍惜為得到。22.2.8*Feb-228-Feb-2212、人亂于心，不寬余請(qǐng)。*Tuesday, February 08, 202213、生氣是拿別人做錯(cuò)的