急性重癥胰腺炎濕熱證動(dòng)物模型建立初探

1、急性重癥胰腺炎濕熱證動(dòng)物模型建立初探         11-04-28 13:29:00     編輯：studa20                作者：齊文杰,張淑文,王紅,張苗苗,文艷,王寶恩【摘要】  目的 通過制作急性重癥胰腺炎大鼠模型,探索急性熱性病濕熱證動(dòng)物模型。方法 采用5%的?；悄懰徕c逆行膽胰管注入制

2、作大鼠急性重癥胰腺炎模型。觀察造模后動(dòng)物體重、體溫、精神、大便、舌苔等,以舌苔厚膩?zhàn)鳛樵u價(jià)動(dòng)物模型濕熱證存在的指標(biāo)。大鼠隨機(jī)分為模型組、假手術(shù)對照組、正常組。造模成功后模型組再根據(jù)舌苔是否厚膩分為舌苔厚膩組(A組)和舌苔正常組(B組)。進(jìn)行血淀粉酶、內(nèi)毒素、腫瘤壞死因子(TNF)測定及胰腺病理學(xué)分析。結(jié)果 急性重癥胰腺炎大鼠造模后出現(xiàn)倦怠、體重下降(P<0.05)、便溏、舌苔厚膩(出現(xiàn)頻率42.6%)、內(nèi)毒素及TNF水平升高,與假手術(shù)組及正常組比較,P<0.05,體溫升高不明顯。結(jié)論 急性重癥胰腺炎大鼠模型是一個(gè)更符合臨床急性熱性病濕熱證發(fā)病過程的動(dòng)物模型,為濕熱證的證型實(shí)質(zhì)探討提

3、供了較為理想的動(dòng)物模型。 【關(guān)鍵詞】  動(dòng)物模型;大鼠;濕熱證;胰腺炎Abstract：Objective To explore animal modeling of acute fever disease with damp-heat syndrome by using rat models of severe acute pancreatitis (SAP). Method SAP was induced by retrograde injection into the biliopancreatic duct of 5% sodium taurocholate. The bod

4、y weight, temperature, mental status, stools, fur of tongue, etc. were observed after model made. A white or yellow and greasy tongue coating was considered as a marker to evaluate damp-heat syndrome of the animal model. Rats were divided into three groups randomly：SAP group, sham operated (SO) grou

5、p and control (C) group. SAP group was divided further into A group (damp-heat syndrome group which a white or yellow and greasy tongue coating existed) and B group (normal tongue coating). The level of serum amylase, endotoxin, TNF and the pathological lesion scores of pancreas tissue were analyzed

6、. Results Lassitude, body weight loss (P<0.05), loose stools and a white or yellow and greasy tongue coating (frequency of occurrence is 42.6%) were noted in parts of rat models. The level of plasma endotoxin and serum TNF were obviously increased (vs the group of SO and C, P<0.05). Body tempe

7、rature of rat models were not significantly changed. Conclusion The SAP rat model can be considered as a good animal model in accordance with acute fever disease with damp-heat syndrome, which supplies a relative ideal animal model for exploring the pathogenesis of damp-heat syndrome.Key words：anima

8、l model;rats;damp-heat syndrome;pancreatitis濕熱證是中醫(yī)急性熱性病中具有特殊規(guī)律的一類征候群。臨床上許多急性感染性疾病患者在發(fā)病過程中表現(xiàn)濕熱證候, 予以西醫(yī)常規(guī)抗感染綜合治療效果不理想,病情纏綿難愈,其病機(jī)及臨床研究已成為近年的熱點(diǎn)。借鑒現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究成果,模擬中醫(yī)熱性病濕熱證發(fā)病機(jī)制,建立理想動(dòng)物模型,亦是揭示熱性病濕熱證本質(zhì)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前,國內(nèi)有關(guān)濕熱證的動(dòng)物模型多根據(jù)中醫(yī)學(xué)關(guān)于濕熱的成因來模擬建立,采用綜合因素造模,即高溫、高濕環(huán)境及高脂飲食,加上病原微生物感染。但臨床常見急性感染性疾病患者,在起病急驟、病程很短的情況下即可出現(xiàn)舌苔厚膩的“濕

9、”象,并沒有高溫、高濕的外在因素影響。對于此類急性熱性病濕熱證證型實(shí)質(zhì)的研究,目前并沒有與病情發(fā)展相符合的動(dòng)物模型可供借鑒。急性重癥胰腺炎(SAP)患者病情發(fā)展過程中常見濕熱證,故本研究采用SAP來建立一個(gè)與臨床急性熱性病濕熱證相符合的動(dòng)物模型,根據(jù)證象(主要是舌苔厚膩)判斷濕熱證的有無,從而建立濕熱證的動(dòng)物模型。1 材料與方法1.1 動(dòng)物SPF級雄性Sprague Dawley(SD)大鼠,購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,體重為(200±50)g,動(dòng)物許可證編號：SCXK-(軍)-2007-004。1.2 分組實(shí)驗(yàn)前觀察大鼠舌苔情況,大鼠正常舌苔為白色,在舌體中部居中

10、處可見。入選大鼠共計(jì)190只。隨機(jī)分為模型組(SAP組)130只按文中所述方法制作SAP模型后,根據(jù)舌苔情況,再分為舌苔厚膩組(A組)、舌苔正常組(B組)、假手術(shù)對照組(SO組)50只、正常對照組(C組)10只。在實(shí)驗(yàn)過程中因麻醉意外及病情發(fā)展等原因死亡的大鼠相關(guān)數(shù)據(jù)不作統(tǒng)計(jì)。1.3 模型制備實(shí)驗(yàn)前每只大鼠稱體重及測量體溫,觀察精神、毛色、大便及舌質(zhì)、舌苔情況,術(shù)前禁食12 h,正常飲水。SAP組：采用膽胰管逆行勻速注入5%?；悄懰徕c(0.1 mL/100 g,購自美國Amresco公司)方法制作模型1。步驟如下：2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg,購自德國Merck公司)腹腔內(nèi)注射麻醉,沿正中

11、線劍突下逐層切開腹壁進(jìn)入腹腔,于十二指腸內(nèi)側(cè)見片狀分布的胰腺,找到膽胰管,肝門部膽胰管用無損傷動(dòng)脈夾夾閉,從膽胰管開口十二指腸系膜緣對側(cè)腸壁穿刺插入4號靜脈穿刺針頭,進(jìn)入腸腔后對準(zhǔn)膨大壺腹中心插入膽胰管約1 cm,微量泵以0.1 mL/min速度推注5%?；悄懰徕c,觀察24 min后拔管,去除動(dòng)脈夾,縫合十二指腸穿刺口并關(guān)腹,術(shù)中注意無菌操作。術(shù)畢皮下注射2 mL/100 g生理鹽水,以補(bǔ)充丟失水分。大鼠清醒后自由飲水、進(jìn)食。SO組：采用0.9%氯化鈉溶液代替5%?；悄懰徕c方法制作模型,具體步驟同上。大鼠清醒后自由飲水、進(jìn)食。C組：正常飲水,進(jìn)食。1.4 檢測項(xiàng)目1.4.1 證象觀察造模后每只

12、大鼠逐日稱體重及測量肛溫,觀察精神、毛色、大便及舌質(zhì)、舌苔等證象。1.4.2 血淀粉酶測定 造模后第1、2、3、5日,SAP組、SO組分別取6只大鼠,麻醉后心臟采血處死,留取血液-20保存?zhèn)溆?采用麥芽糖苷法測定血漿淀粉酶水平。1.4.3 胰腺組織病理檢查造模后第1、2、3、5日,SAP組、SO組分別取6只大鼠,麻醉后心臟采血處死,留取胰腺組織,4%多聚甲醛固定,常規(guī)蘇木精-伊紅染色行病理檢查。胰腺組織經(jīng)固定后,常規(guī)石蠟包埋,4 m切片。二甲苯脫蠟,經(jīng)各級乙醇至水洗,入蘇木精染液染色10 min,自來水沖洗。鹽酸乙醇分化約10 s,至細(xì)胞核著色較深,其他結(jié)構(gòu)無色時(shí)為宜。入自來水緩洗約20 mi

13、n,使蘇木精“藍(lán)化”,胞核呈藍(lán)色。經(jīng)蒸餾水洗后,入伊紅染液染色約10 min,用蒸餾水洗去多余的伊紅。常規(guī)脫水,透明,封片。應(yīng)注意在蘇木精和伊紅染色時(shí),須隨時(shí)在顯微鏡下觀察是否適當(dāng),如染色過淺,應(yīng)重復(fù)染色。1.4.4 血漿內(nèi)毒素測定大鼠血漿內(nèi)毒素測定采用鱟試劑基質(zhì)偶氮顯色定量法。1.4.5 血清腫瘤壞死因子測定按照腫瘤壞死因子(TNF-)定量酶聯(lián)檢測試劑盒說明書進(jìn)行測定。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS11.5軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有計(jì)量數(shù)據(jù)采用±s表示,組間比較采用單因素方差分析及q檢驗(yàn)(Student Newman Keuls Test)。分類計(jì)數(shù)資料采用Pearson Chi-square (2檢驗(yàn))統(tǒng)計(jì)方法統(tǒng)計(jì)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 造模后大鼠證象變化2.1.1 舌苔改變SAP組：與C組比較,大鼠舌象出現(xiàn)明顯變化,部分大鼠舌苔向中后部逐漸增厚,至第5日存活大鼠中出現(xiàn)厚膩苔者共計(jì)29只,發(fā)生率42.6%,其中黃膩苔10只