腺相關(guān)病毒和人γ-干擾素基因重組體轉(zhuǎn)染淋巴細胞的研究

1、    腺相關(guān)病毒和人-干擾素基因重組體轉(zhuǎn)染淋巴細胞的研究        【摘要】目的觀察腺相關(guān)病毒和人-干擾素的重組體pWIG轉(zhuǎn)染淋巴細胞及在細胞內(nèi)表達情況。方法將pWIG以DNA-磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染人淋巴細胞株H9，再分別用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、逆轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)等方法在DNA、RNA和蛋白質(zhì)水平研究該重組體導(dǎo)入細胞和在細胞內(nèi)表達的情況。結(jié)果轉(zhuǎn)染pWIG的H9細胞的DNA和RNA經(jīng)PCR和RT-PCR檢測均有504 bp的DN

2、A條帶；用ELISA可測出-干擾素的表達量為17.2 pg/3×106細胞。結(jié)論重組體pWIG用DNA-磷酸鈣共沉淀法導(dǎo)入細胞后，轉(zhuǎn)錄HuIFN- mRNA，并翻譯人-干擾素蛋白。為基因治療的進一步研究打下基礎(chǔ)。【關(guān)鍵詞】基因療法；干擾素；腺相關(guān)病毒；淋巴細胞 Transfection and expression of the recombinant adeno-associated virus carrying human interferon- in human lymphocyteZHU Haihong, CHEN Zhi, ZHANG Mingtai, et al.（Ins

3、titute of Infectious Diseases,the First Affiliated Hospital,Medical college of Zhejiang University,Hangzhou 310003, China）【Abstract】ObjectiveIn order to study the transfection and expression of the recombinant pWIG of Adeno-associated virus and Human interferon-(HuIFN-) in human lymphocyte.MethodsAf

4、ter transfecting pWIG into human lymphocyte via calcium phosphate, DNA, RNA and protein extracted from transfected cells were detected by polymerase chain reaction(PCR), reverse transcription PCR(RT-PCR) and ELISA. ResultsThe 504 bp bands were detected from PCR and RT-PCR products of the DNA and RNA

5、 from the cells transfected, and HuIFN- protein were detected to be 17.2 pg/3×106 cells by ELISA.ConclusionThe recombinant pWIG could produce HuIFN- mRNA after the transfection via calcium phosphate, and translate corresponding protein further. This lays ground for the further research of gene

6、therapy.【Key words】Gene therapy; Interferon ; Adeno-associated virus; Lymphocyte腺相關(guān)病毒(AAV)是目前基因治療的常用載體系統(tǒng)之一。因其具有穩(wěn)定表達、定點整合、安全性較高等優(yōu)點而受到重視。我們在以往工作的基礎(chǔ)上1，將已構(gòu)建成功的腺相關(guān)病毒和人-干擾素(HuIFN-)基因的重組體pWIG轉(zhuǎn)染源于人淋巴細胞的H9細胞株，在DNA、RNA、及蛋白水平探討其表達狀態(tài)。材料和方法一、材料(一)DNA質(zhì)粒和細胞株pwp19載體由美國阿肯薩斯大學提供，為帶有腺相關(guān)病毒末端反向重復(fù)序列的真核表達載體，詳細資料參見文獻2。重組體p

7、WIG為本研究小組構(gòu)建，是腺相關(guān)病毒載體pwp19和包含信號肽的HuIFN-的編碼區(qū)cDNA的重組體。pGEM-1-IFN-質(zhì)粒內(nèi)帶有人IFN- cDNA全基因，由軍事醫(yī)學科學院提供。H9細胞株：是本所長期保存的傳代細胞株，為有缺陷的CD4+ T淋巴細胞株。(二)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和PCR試劑M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、耐熱DNA聚合酶、dNTPs混合液等均購自美國Gibco BRL公司。Hu-IFN-引物是根據(jù)Devos等3的報道合成，其擴增產(chǎn)物為含信號肽的504 bp HuIFN-編碼區(qū)cDNA，由美國Gibco BRL公司合成。上游引物：5-GCATGAAATATACAAGTT

8、ATATCTTGG-3，下游引物：5-ATTTACTGGGATGCTCTTCGACC-TC-3。Oligo(dT)15：購自美國Promega公司。(三)HuIFN-酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑購自晶美生物工程公司(美國Genzyme公司進口分裝)。(四)培養(yǎng)基試劑RPMI 1640和Hepes粉劑購自美國Gibco BRL公司；超級小牛血清購自浙江杭州四季青生物制品研究所，按說明書配制。(五)其他試劑Trizol Reagent購自美國Gibco BRL公司；DNA酶(RNase-free)購自德國寶靈曼公司。二、方法(一)重組體轉(zhuǎn)染H9細胞用DNA-磷酸鈣共沉淀法。首先將大量擴增

9、后的重組體pWIG制成DNA-磷酸鈣懸液，靜置0.5 h后重懸3×106個H9細胞，置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)0.5 h后加入含10%小牛血清的1×RPMI 1640，參照文獻4進行。12 h后更換培養(yǎng)液，60 h后收獲細胞。(二)3組對照細胞的設(shè)立1.轉(zhuǎn)染pwp19的細胞；2.經(jīng)磷酸鈣懸液處理的細胞(不含質(zhì)粒DNA)；3.未處理細胞。(三)細胞收獲保留細胞培養(yǎng)上清。用生理鹽水洗滌細胞4次后收集細胞，并保留最后1次的細胞洗滌液。同時以Trizol連續(xù)抽提實驗組和對照組細胞內(nèi)總RNA、DNA和蛋白質(zhì)，按照產(chǎn)品說明書進行操作。(四)PCR檢測重組體導(dǎo)入細胞內(nèi)情況實驗組和對照組細胞內(nèi)抽提

10、出的DNA以及細胞洗滌液直接用HuIFN-引物作PCR。程序為：94變性1 min,55退火40 s，72延伸40 s，三步為一個循環(huán)，共35個循環(huán)，最后72延伸18 min。具體操作參照文獻4。(五)RT-PCR檢測重組體在細胞內(nèi)mRNA的表達情況實驗組和對照組細胞內(nèi)抽提出的總RNA經(jīng)DNase 消化后，以O(shè)ligo(dT)15作為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的引物，37水浴1 h后以HuIFN-引物作PCR，反應(yīng)程序同前。具體操作參照文獻4。(六)ELISA檢測細胞內(nèi)HuIFN-蛋白的表達情況實驗組和對照組細胞的培養(yǎng)上清和細胞內(nèi)抽提的蛋白質(zhì)，按檢測試劑盒說明書進行檢測。結(jié)果一、PCR檢測重組體導(dǎo)入細胞內(nèi)情況

11、經(jīng)pWIG轉(zhuǎn)染的細胞DNA擴增出504 bp條帶，三組對照細胞的DNA和細胞洗滌液均未擴增出504 bp條帶，見1。說明pWIG已成功導(dǎo)入H9細胞內(nèi)。     1.pGEM-1-IFN-的PCR產(chǎn)物(504 bp)；2.100 bp ladder(Promega公司)；3.洗滌細胞的0.9% NaCl的PCR產(chǎn)物；4.轉(zhuǎn)染pWIG細胞的DNA的PCR產(chǎn)物(504 bp)；5.轉(zhuǎn)染pwp19細胞的DNA的PCR產(chǎn)物；6.磷酸鈣處理細胞的DNA的PCR產(chǎn)物；7.未處理細胞的DNA的PCR產(chǎn)物1細胞內(nèi)抽提DNA的PCR結(jié)果   &

12、#160; 1.轉(zhuǎn)染pwp19細胞總RNA的RT-PCR產(chǎn)物；2.磷酸鈣處理細胞總RNA的RT-PCR產(chǎn)物；3.未處理細胞總RNA的RT-PCR產(chǎn)物；4.水作空白對照；5.轉(zhuǎn)染pWIG細胞總RNA的RT-PCR產(chǎn)物(504 bp)；6.pGEM-1-IFN-的PCR產(chǎn)物(504 bp)；7.100 bp ladder(Promega公司)2細胞內(nèi)抽提總RNA的RT-PCR結(jié)果二、RT-PCR檢測重組體在細胞內(nèi)的mRNA表達情況經(jīng)pWIG轉(zhuǎn)染的細胞總RNA以O(shè)ligo(dT)15作引物進行逆轉(zhuǎn)錄擴增出504 bp條帶，3組對照細胞的總RNA均未擴增出任何條帶，見2。提示pWIG在細胞內(nèi)已成功表達

13、出HuIFN- mRNA，且其3末端帶有polyA。三、ELISA檢測細胞內(nèi)HuIFN-蛋白的表達情況轉(zhuǎn)染pWIG的細胞：3×106細胞抽提出的蛋白中檢測出17.2 pg HuIFN-蛋白，培養(yǎng)上清中未測到HuIFN-蛋白。3組對照細胞：培養(yǎng)上清和細胞內(nèi)抽提的蛋白中均未檢測到HuIFN-蛋白。提示轉(zhuǎn)染pWIG的細胞有HuIFN-蛋白表達，而對照組細胞則未檢測到。討論目的基因和靶細胞的選擇和獲得以及基因轉(zhuǎn)移方式的選擇均是基因治療的重要問題。以病毒載體介導(dǎo)為主的生物學方法是目前常用的基因轉(zhuǎn)移方式之一。在各種病毒載體系統(tǒng)中AAV載體系統(tǒng)因安全性相對較高5、潛伏感染人體時可以特異地整合到宿主

14、細胞的19號染色體上6、外源基因可以長期穩(wěn)定表達7、分裂期細胞和靜止期細胞均能被感染等優(yōu)點8引起人們的重視。-干擾素作為一種重要的細胞因子，具有較高的抗腫瘤和抗肝纖維化活性，已在臨床廣泛應(yīng)用。肝臟疾病基因治療的靶細胞，常選擇外周血淋巴細胞(PBL)、肝癌組織中的腫瘤浸潤性淋巴細胞、肝細胞及肝癌細胞等。其中外周血淋巴細胞易從體內(nèi)取出、分離；回輸方便；體外在白細胞介素-2刺激下可進行培養(yǎng)和擴增；可有效地被外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，并可耐受篩選過程的操作；回輸人體后，能繼續(xù)存活且具有生物學功能9。因此本研究采用PBL作為靶細胞。利用基因治療的方法在真核細胞內(nèi)表達的-干擾素，其空間結(jié)構(gòu)比重組蛋白更接近天然干擾素，

15、且具有局部濃度高、分泌到細胞外可發(fā)揮旁分泌功能等優(yōu)點，從而可發(fā)揮更強的生物學效應(yīng)。本研究在先前工作的基礎(chǔ)上，將已構(gòu)建好的重組體pWIG轉(zhuǎn)染淋巴細胞，收獲細胞后分別用PCR、RT-PCR和ELISA等方法從DNA、RNA和蛋白水平研究重組體導(dǎo)入細胞和在細胞內(nèi)表達情況。pWIG轉(zhuǎn)染H9細胞時，設(shè)立3組對照：第一組為pwp19轉(zhuǎn)染的H9細胞；第二組為不含有質(zhì)粒DNA的磷酸鈣處理的H9細胞；第三組為未作任何處理的細胞。結(jié)果提示轉(zhuǎn)染pwp19載體、磷酸鈣處理以及普通的體外培養(yǎng)條件均不能促使H9細胞產(chǎn)生HuIFN-。實驗組的結(jié)果提示重組體pWIG以DNA-磷酸鈣共沉淀法導(dǎo)入細胞后，可有效地轉(zhuǎn)錄HuIFN-

16、 mRNA，并表達HuIFN-蛋白，但產(chǎn)量較低。理論上，帶有信號肽的細胞因子可以通過細胞膜分泌到細胞外，發(fā)揮其旁分泌的功能。我們構(gòu)建的重組體中的HuIFN-基因含有信號肽的全編碼區(qū)，上清中未檢測到HuIFN-蛋白，可能是由于該蛋白分泌到細胞外后被培養(yǎng)基稀釋，濃度低于試劑盒的檢測靈敏度所致。  本課題為國家自然科學基金資助項目(39570653)作者單位：朱海紅（310003杭州，浙江大學醫(yī)學院附屬一院傳染病研究所）陳智（310003杭州，浙江大學醫(yī)學院附屬一院傳染病研究所）章明太（310003杭州，浙江大學醫(yī)學院附屬一院傳染病研究所）姚航平（310003杭州，浙江大學醫(yī)學院

17、附屬一院傳染病研究所）丁列明（美國阿肯薩斯大學病理系）參考文獻1，陳智，朱海紅，章明太，等.腺相關(guān)病毒和人-干擾素基因重組體的構(gòu)建.中國學術(shù)期刊文摘，1998，4：1259-1260.2，Nahreini P, Woody MJ, Zhou SZ, et al. Versatile adeno-associated virus 2-based vectors for constructing recombinant virions. Gene, 1993,124:257-262.3，Devos R, Cheroutre H, Taya Y, et al. Molecular cloning o

18、f human immune interferon cDNA and its expression in eukaryotic cells. Nucleic Acids Res, 1982,10:2487-2501.4，Sambrook J, Fristch EF, Maniatis J. Moecular cloning laboratory mannual, 2nd ed. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989.5，Marshall E. Gene therapy's growing pains. Science, 1995,269:1050-1055.6，Goldspiel BR, Green L, Cali