四肝組織中核酸的提取和鑒定

1、實驗四肝組織中核酸的提取和鑒定【目的】驗證核酸的三大組成成分。熟悉組織中核酸的提取與鑒定的基本操作方法。【原理】動物組織細(xì)胞中的核糖核酸（RNA）與脫氧核糖核酸（DNA）大部分與蛋白質(zhì)結(jié)合而形成核蛋白。 被三氯醋酸沉淀的核蛋白，先用 95%的乙醇加熱去除附著在沉淀上的脂類雜質(zhì)，再用 1.7mol/L NaCl溶液提取出核酸的鈉鹽，然后加入乙醇即可使核酸鈉鹽沉淀析出。RNA與 DNA均可被硫酸水解產(chǎn)生磷酸、含氮堿基( 嘌呤與嘧啶 ) 及戊糖（ RNA為核糖，DNA為脫氧核糖） 。此三類物質(zhì)分別可按照下述原理鑒定。1. 磷酸 磷酸與鉬酸銨試劑作用生成黃色磷鉬酸，磷鉬酸中的鉬在有還原劑（硫酸亞鐵）存

2、在時可被還原成藍色的鉬藍。根據(jù)此呈色反應(yīng)即可鑒定磷酸的存在。2. 嘌呤堿 根據(jù)嘌呤堿能與硝酸銀產(chǎn)生灰褐色的絮狀嘌呤銀化合物而鑒定。3. 戊糖根據(jù)核糖經(jīng)濃鹽酸或濃硫酸作用則生成糠醛，后者能與3， 5 二羥甲苯縮合而形成綠色化合物而鑒定。CHCH33CHOHC OH濃酸HC OH-H2OHC OHCH2OHHOOHOCO CHOO3，5- 二羥甲苯H3COH核糖糠醛綠色化合物脫氧核糖在濃酸中生成 - 羥基 - - 酮基戊醛，它和二苯胺作用生成藍色化合物。CHOCHOHC H濃酸HC H二苯胺HC OH-H2 OHC H藍色化合物HC OHC OCH OHCH OH22脫氧核糖 - 羥基- - 酮基

3、戊醛【器材】剪刀、鑷子、玻棒、濾紙、試管、試管架、蒸發(fā)皿、勻漿器、離心機、沸水浴箱?！驹噭?. 生理鹽水。2. 0.12 mol/L三氯醋酸溶液。3. 95% 乙醇。4. 10% NaCl 溶液NaCl 10g 溶于蒸餾水中，加至100ml。5. 0.92 mol/L H 2SO4取濃 H2SO4（比重 1.84 ，含量98%） 5ml 加入蒸餾水中，加水至 100ml 。6. 鉬酸銨試劑鉬酸銨 3g，溶于 70ml 蒸餾水中，逐漸加入濃24，冷卻后再加至100ml，混H SO 14ml勻備用。7.硫酸亞鐵試劑硫酸亞鐵10.6g ，硫脲 5g，加蒸餾水溶解并加水至500ml，冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?

4、. 濃氨水。9. 0.29mol/L AgNO 3取 AgNO3 5g 加蒸餾水溶解并稀釋至100ml，于棕色瓶避光保存。10. 3,5 二羥甲苯試劑取濃鹽酸100ml ，加入 FeCl 3 6H2O 100mg 及二羥甲苯100mg 混勻溶解后，置于棕色瓶中。臨用前配制，冰箱保存。（市售 3,5 二羥甲苯不能直接使用，必須用苯重結(jié)晶12次，并用活性碳脫色后方可使用）。11. 二苯胺試劑取 1g 純的二苯胺溶于 100ml 冰乙酸中，加入 2.75ml 濃硫酸，盛于棕色瓶中，臨用前配制。【操作】1. 核酸的提取與分離：（ 1）將新鮮豬肝剪碎置于勻漿器中，加入等量的生理鹽水，制成勻漿。（ 2）將

5、 5ml 肝勻漿置于離心管內(nèi)，立即加入0.12mol/L三氯醋酸5ml ，用玻棒攪勻，靜置 8 分鐘后離心。（ 3）傾去上清液，加 95% 乙醇 5ml，用玻棒攪勻，再用帶有長玻管的木塞塞緊離心管口，在水浴中煮沸 2 分鐘，冷卻后離心。（ 4）將離心管倒置于濾紙上，使濾紙吸干乙醇。沉淀中再加入10% NaCl 溶液 4ml，置于沸水浴中加熱8 分鐘，并用玻棒不斷攪拌，取出冷卻后再離心。（ 5）將上清液傾入另一離心管內(nèi)，再離心一次，去除可能存在的微量殘渣。將上清液倒入燒杯內(nèi)。（ 6）取等量的在水浴中冷卻過的 95% 乙醇逐滴加入小燒杯內(nèi)，即可見白色沉淀逐漸析出。靜置 10 分鐘后，將小燒杯中沉淀

6、物移入離心管內(nèi)離心，棄去上清液即得到核酸鈉的白色沉淀。2. 核酸的水解在含有核酸鈉的離心管內(nèi)加入0.92mol/L的H2SO4 4ml，用玻棒攪勻，再用帶有長玻管的軟木塞塞緊管口，在沸水浴中加熱15 分鐘。3. 核酸組成成分的鑒定（ 1）磷酸的鑒定：按下表操作。表 3-3 核酸中磷的鑒定加入物（滴）測定管對照管核酸水解液5 滴0.92mol/L H 2SO4 溶液5 滴鉬酸銨試劑3 滴3 滴硫酸亞鐵試劑10 滴10 滴（ 2）嘌呤堿的鑒定：按下表操作。表 3-4嘌呤堿的鑒定加入物（滴）測定管對照管核酸水解液10 滴0.92mol/L H 2SO4 溶液10 滴濃氨水?dāng)?shù)滴（使呈堿性）數(shù)滴（使呈堿性）0.29mol/L AgNO 35 滴5 滴觀察加入AgNO3后有何變化。靜置15 分鐘后，再比較兩管的沉淀.（ 3）核糖的鑒定：按下表操作。表 3-5 核糖的鑒定加入物（滴）測定管對照管核酸水解液4 滴0.92mol/L H 2SO4 溶液4 滴3， 5- 二羥甲基試劑6 滴6 滴混勻，放沸水浴中加熱10 分鐘，觀察兩管顏色有何不同。（ 4）脫氧核糖的鑒定：按下表操作。表 3-6 脫氧核糖的鑒定加入物（滴）測定管對照管核酸水解液10 滴0.92mol/L H 2SO4 溶液10 滴二苯胺試劑15 滴15 滴混勻