The promotion of cerebral ischemia recovery in rats by laminin

1、層粘連蛋白結(jié)合腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子促進(jìn)大鼠腦層粘連蛋白結(jié)合腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子促進(jìn)大鼠腦缺血復(fù)蘇缺血復(fù)蘇Page 2n 中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所來源來源生物材料（生物材料（BiomaterialsBiomaterials）( (Doi:10.1016/j.biomaterials.2Doi:10.1016/j.biomaterials.2011.03.072011.03.072）Page 3n 腦缺血（腦梗塞）是由于腦動脈狹窄加重或腦缺血（腦梗塞）是由于腦動脈狹窄加重或完全閉塞，導(dǎo)致腦組織缺血、缺氧、壞死，完全閉塞，導(dǎo)致腦組織缺血、缺氧、壞死，從而引起神經(jīng)功能障礙的一種腦血管病。從而引起神

2、經(jīng)功能障礙的一種腦血管病。n 腦缺血是很常見的中樞神經(jīng)損傷，其主要致腦缺血是很常見的中樞神經(jīng)損傷，其主要致病因素有：高血壓病、冠心病、糖尿病等，病因素有：高血壓病、冠心病、糖尿病等，多見于多見于4570歲中老年人。歲中老年人。n 生存下來的腦缺血損傷病人大都會有后遺癥，生存下來的腦缺血損傷病人大都會有后遺癥，影響正常生活，嚴(yán)重的腦缺血病人生活不能影響正常生活，嚴(yán)重的腦缺血病人生活不能自理甚至危及生命安全。自理甚至危及生命安全。n 中樞神經(jīng)再生是再生醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。中樞神經(jīng)再生是再生醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。病況簡潔病況簡潔Page 4腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）對神經(jīng)元的缺

3、血性損傷具有）對神經(jīng)元的缺血性損傷具有防治作用防治作用, 可望成為新一代的缺血性腦血管病的有效治療藥可望成為新一代的缺血性腦血管病的有效治療藥物。但因物。但因BDNF 屬蛋白質(zhì)大分子物質(zhì)屬蛋白質(zhì)大分子物質(zhì), 難透過血腦屏障難透過血腦屏障, 為此為此影響了其臨床應(yīng)用影響了其臨床應(yīng)用。層粘連蛋白層粘連蛋白(Laminin）一種豐富的細(xì)胞外基質(zhì)一種豐富的細(xì)胞外基質(zhì)。在中樞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，腦缺血后神經(jīng)系統(tǒng)中，腦缺血后在在缺血區(qū)域缺血區(qū)域高度表達(dá)。高度表達(dá)。我們這里融合層粘連蛋白結(jié)合域我們這里融合層粘連蛋白結(jié)合域（laminin-binding domain，LBD,NtA插入插入pET-28a形成形

4、成PET-LBD)和和BDNF形成形成LBD-BDNF。LBD-BDNF可以針對累積層可以針對累積層粘連蛋白粘連蛋白，在缺血區(qū)在缺血區(qū)，發(fā)揮靶向治療缺血損傷后神經(jīng)發(fā)揮靶向治療缺血損傷后神經(jīng)元。元。名詞介紹名詞介紹Page 5LBD-BDNF的構(gòu)造的構(gòu)造n Gene of NtA was constructed and inserted into pET-28a (Novage, San Diego, CA) to construct pET-LBD as described before.n A human BDNF DNA was amplified by PCR as described

5、before.n The BDNF DNA fragments were inserted individually into pET-LBD and pET-28a to construct the expression vectors for BDNF with LBD (pET-LBD-BDNF) or without LBD (pET-NAT-BDNF). n E.coli BL21 (DE3) strain-carried pET-LBD-BDNF or pET-NAT-BDNF were cultured.Page 6檢測純化檢測純化n The expression of reco

6、mbinant proteins was analyzed by electrophoresis on a 15% (wt/vol) sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) under reducing condition and western-blotting with mouse antibody to polyhistidine (1:1000 dilution; Sigma).n The purified NAT-BDNF or LBD-BDNF was refolded in the

7、glutathione redox-refolding system, and stored at 80 C.Page 7模擬模擬Page 8體外電泳分析層粘連蛋白結(jié)合能力體外電泳分析層粘連蛋白結(jié)合能力通過十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（通過十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）測定純化的）測定純化的NAT-BDNF和和LBD-BDNF 。使。使用用ELISA分析以確定是否分析以確定是否LBD-BDNF具有層粘連蛋具有層粘連蛋白結(jié)合能力。在每個(gè)指示的點(diǎn)，在白結(jié)合能力。在每個(gè)指示的點(diǎn)，在OD 405 nm處的處的LBD-BDNF為顯著高于的為顯著高于的NAT-BDNF，表明，表明

8、LBD-BDNF對層粘連蛋白對層粘連蛋白結(jié)合能力大于結(jié)合能力大于NAT-BDNFPage 9體內(nèi)體內(nèi)n 外科手術(shù)外科手術(shù)（封堵裝置送到前動脈）（封堵裝置送到前動脈）對大鼠腦缺血模型的永對大鼠腦缺血模型的永久性大腦中動脈閉塞（久性大腦中動脈閉塞（MCAO），制備了大鼠大腦中動脈制備了大鼠大腦中動脈堵塞的腦缺血模型堵塞的腦缺血模型24只大鼠只大鼠control組組NAT-BDNF組組LBD-BDNF組組Page 10層粘連蛋白在體內(nèi)的結(jié)合分析層粘連蛋白在體內(nèi)的結(jié)合分析Page 11神經(jīng)元退化分析神經(jīng)元退化分析一周后，一周后，LBD-BDNF治療組腦缺血大腦半球的梗塞面積顯治療組腦缺血大腦半球的梗塞面積顯著減少；四周后，海馬區(qū)域神經(jīng)發(fā)生明顯增強(qiáng)，神經(jīng)行為著減少；四周后，海馬區(qū)域神經(jīng)發(fā)生明顯增強(qiáng)，神經(jīng)行為能力明顯恢復(fù)。這一系列結(jié)果表明：能力明顯恢復(fù)。這一系列結(jié)果表明：LBD-BDNF可以通過可以通過結(jié)合于腦缺血部位的層粘連蛋白來發(fā)揮其定向的神經(jīng)營養(yǎng)結(jié)合于腦缺血部位的層粘連蛋白來發(fā)揮其定向的神經(jīng)營養(yǎng)作用，促進(jìn)腦缺血損傷的恢復(fù)。作用，促進(jìn)腦缺血損傷的恢復(fù)。Page 12總結(jié)總結(jié)