探討楮實(shí)提取物的體外抗氧化活性

1、探討楮實(shí)提取物的體外抗氧化活性    摘要：  目的 探討楮實(shí)提取物的體外抗氧化活性。方法 先用80%乙醇，然后用蒸餾水對楮實(shí)進(jìn)行提取。其中醇提取物依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，水提部分經(jīng)醇沉、干燥后得到楮實(shí)粗多糖。運(yùn)用羥基（·OH）自由基體系、二苯代苦味基肼（DPPH·）自由基體系和對Fe3+的還原能力實(shí)驗(yàn)，比較楮實(shí)各提取物的抗氧化活性。結(jié)果 楮實(shí)提取物對·OH自由基和DPPH·自由基均有較好的清除作用，其中總醇提取物對·OH自由基的清除能力最強(qiáng)，其IC50值為0.28 mg/ml

2、；乙酸乙酯提取物對DPPH·自由基的清除效果最好，其IC50值達(dá)到0.08 mg/ml；各提取物對Fe3+均有較強(qiáng)的還原能力，乙酸乙酯提取物還原效果最為明顯。結(jié)論 楮實(shí)提取物具有一定的抗氧化活性，在抗衰老方面有廣泛的應(yīng)用前景。 關(guān)鍵詞： 楮實(shí)；抗氧化活性；清除自由基；還原力楮實(shí)子具有活血理氣、補(bǔ)腎清肝、明目、利尿的功效，多用于腰膝酸軟、虛勞骨蒸、頭暈?zāi)垦?、目生翳膜、水腫脹滿等癥1，2。一些含楮實(shí)子的經(jīng)典方藥經(jīng)多年臨床驗(yàn)證具有確切的抗衰老、促智作用3。機(jī)體內(nèi)氧化自由基增加是導(dǎo)致衰老的主要原因，清除自由基可起到延年益壽的作用4。近年來研究發(fā)現(xiàn)楮實(shí)子油及楮實(shí)子黃酮成分有顯著的抗氧化和清除及

3、抑制氧自由基作用5；楮實(shí)子紅色素能顯著清除超氧陰離子及羥基(·OH)自由基，抑制H2O2誘導(dǎo)小鼠紅細(xì)胞溶血和肝勻漿自氧化，對肝線粒體也有保護(hù)作用6。但目前還未見到對楮實(shí)聚花果進(jìn)行抗氧化活性評價(jià)的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用水楊酸法、二苯代苦味基肼自由基(DPPH·)法、Fe3+還原能力的方法對楮實(shí)不同極性溶劑提取物體外抗氧化能力進(jìn)行評價(jià)，為楮實(shí)更廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥和開發(fā)新型保健品提供理論依據(jù)。1  材料與方法1.1  材料與試劑藥材于2009年7月采自貴州省貴陽市藥用植物園，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院孫慶文老師鑒定為構(gòu)樹Broussonetia papyrifera(L.)Ven

4、t.的成熟果實(shí)。DPPH·(百靈威公司)；抗壞血酸（Vc）、無水乙醇、H2O2、水楊酸、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、三氯化鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、三氟乙酸均為國產(chǎn)分析純試劑，乙醇為食用級(jí)。1.2  儀器與設(shè)備HP8453型紫外可見分光光度計(jì)(惠普公司)；JA2003精密電子天平(上海恒平科學(xué)儀器有限公司)；DK9811電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)。1.3  提取與制備楮實(shí)干燥粉碎，80%乙醇回流提取5次，每次回流2 h，乙醇提取液減壓濃縮至無醇味，得楮實(shí)總醇提物。取適量醇提物用水混懸后依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，各萃取液及萃取后的水層部分減

5、壓濃縮至固體，真空干燥后得石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物及水層部分，作為待測樣品置于干燥器中保存。    將乙醇浸提后的藥材殘?jiān)谑覝叵聯(lián)]去乙醇，加入蒸餾水，沸水浴提取5次，每次2 h。合并水提液減壓濃縮至一定體積，加入乙醇沉淀多糖，乙醇最終濃度80%，沉淀真空干燥后即為楮實(shí)水提粗多糖，作為待測樣品置干燥器中保存?zhèn)溆谩?.4  抗氧化活性測定1.4.1  清除·OH自由基7 采用Fenton反應(yīng)，利用H2O2與Fe2+混合產(chǎn)生·OH自由基，在該體系中加入水楊酸捕捉·OH自由基并產(chǎn)生有色物質(zhì)，

6、該物質(zhì)在510 nm處有最大吸收。取各萃取物50 mg，用無水乙醇溶解并定容至25 ml；取粗多糖50 mg用蒸餾水溶解，定容至25 ml，配制得2 mg/ml的各樣品質(zhì)量濃度，再以該質(zhì)量濃度配制成所需濃度。依次加入樣品4 ml，9 mmol/L FeSO4 0.5 ml，9 mmol/L水楊酸0.5 ml，8.8 mmol/L H2O2 0.5 ml。該體系于37水浴中加熱30 min，于510 nm處測定樣品吸光度（Ai）。用4 ml蒸餾水代替體系中的樣品，測定得空白吸光度（A0）。向體系中加入蒸餾水0.5 ml代替8.8 mmol/L H2O2，測定樣品本底吸光度（Aj）。每個(gè)質(zhì)量濃度樣

7、品做3個(gè)平行，取其平均值，以Vc作陽性對照，按下式計(jì)算清除率：K(%)=A0-(Ai-Aj)/A0×100。1.4.2  清除DPPH·自由基8 DPPH·自由基是一種穩(wěn)定的自由基，在有機(jī)溶劑中呈紫色，在517 nm波長有較大吸收，當(dāng)加入抗氧化劑一部分自由基被清除，使得在該波長下吸收減弱，可借此來評價(jià)物質(zhì)的抗氧化活性。取各萃取物50 mg，用無水乙醇溶解并定容至25 ml；取粗多糖50 mg，用蒸餾水溶解并定容至25 ml，配制得2 mg/ml的各樣品質(zhì)量濃度，再以該質(zhì)量濃度配制成所需濃度；以無水乙醇配制0.16 mmol/L DPPH·溶液，

8、避光保存。取3 ml待測樣品溶液加入3 ml DPPH·溶液于25水浴中加熱15 min，在517 nm測得試樣吸光度（Ai）。取3 ml蒸餾水代替樣品測得空白吸光度（A0）。向3 ml樣品中加入3 ml蒸餾水測得樣品本底吸光度（Aj），每個(gè)質(zhì)量濃度樣品做3個(gè)平行，取平均值。以Vc作陽性對照，按下式計(jì)算清除率：K(%)=A0-(Ai-Aj)/A0×100。1.4.3  Fe3+還原能力測定9 取2.5 ml不同質(zhì)量濃度的樣品乙醇溶液，加入0.2 mol/L磷酸緩沖液2.5 ml及1%鐵氰化鉀2.5 ml，50水浴反應(yīng)20 min后急速冷卻，加入10%三氟乙酸溶液2

9、.5 ml混勻，4 000 r/min離心10 min，取上清液5 ml，加入4 ml蒸餾水及0.1% FeCl3 1 ml，10 min后于700 nm處測定吸光值。以Vc作為陽性對照。2  結(jié)  果2.1  對·OH自由基的清除作用 由圖1可以看出，大部分提取物對·OH自由基都表現(xiàn)出一定程度的清除能力，并在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)呈明顯的量效關(guān)系，但各部分提取物的清除能力都弱于Vc。清除能力大小依次為總醇提取物氯仿提取物正丁醇提取物粗多糖水層乙酸乙酯提取物?？紤]到樣品本底吸收的影響，本實(shí)驗(yàn)樣品最高濃度為1 mg/ml，未測定更高濃度樣品的清除作用。石油醚提取部分效果不明顯，故未對其進(jìn)行比較分析。    楮實(shí)提取物對·OH自由基清除活性的半清除率濃度（IC50，mg/ml）值順序?yàn)椋篤c