總黃曲霉毒素ELISA定量檢測試劑盒研制

1、總黃曲霉毒素ELISA定量檢測試劑盒研制         07-08-10 16:27:00     作者：計融，柳楨，江濤，鄭    編輯：studa20【摘要】  目的 研究并建立敏感、特異和快速的針對食品中總黃曲霉毒素的ELISA檢測方法，形成具有我國自主知識產(chǎn)權的快速定量檢測試劑盒。方法 在生產(chǎn)抗總黃曲霉毒素單克隆抗體基礎上，利用間接競爭ELISA方法，研制出食品中總黃曲霉毒素快速檢測試劑盒，并對試劑盒的各項技術參數(shù)進

2、行測定。結(jié)果 該試劑盒對黃曲霉毒素B+G標準品的最低檢出濃度為026ngml，標準曲線的線性范圍為0262000ngml，線性方程y=-04463x+03532(R2=09915)；對黃曲霉毒素B+G50的抑制濃度為208ngml；試劑盒的條內(nèi)變異系數(shù)為418，條間變異系數(shù)為521，抗體親和力常數(shù)為152×10-10molL；對玉米3個加標水平的平均回收率分別為9863，9456和11205%；對花生的3個加標水平的平均回收率分別為8866%，8750和8560。試劑盒37可放置96h以上；試劑盒對黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的交叉反應率分別為100，575，104和19，與其他

3、真菌毒素無交叉反應。結(jié)論 研制出的ELIS試劑盒能定量檢測食品中總黃曲霉毒素。 【關鍵詞】  總黃曲霉毒素黃曲霉毒素(Aflatoxin)是黃曲霉（XspeEillusflavus)和寄生曲霉(Aparasiticus)等產(chǎn)生的一組結(jié)構類似的次生代謝產(chǎn)物。據(jù)Gabal等1報道，有40的黃曲霉菌株培養(yǎng)物可同時測出黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2）。同時黃曲霉毒素的毒性具有協(xié)同作用，因此，90以上的國家都制定了食品中總黃曲霉毒素的限量標準。目前總黃曲霉毒素的檢測方法主要有薄層層析法、色譜法。我國執(zhí)行的食品中總黃曲霉毒素B1+B2+G+G2的國家標準

4、測定方法是薄層色譜法和微柱篩選法，均為目測半定量法，最低檢出濃度為5g/kg2。這些方法因受本身的限制，精確度低、敏感性差；樣品前處理過程復雜費時；或需要價格昂貴的儀器，檢測成本高，難以推廣應用，影響了糧油食品中黃曲霉毒素的有效監(jiān)測。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)是在免疫學和細胞工程學基礎上發(fā)展的一種微量檢測技術，特別適合于對黃曲霉毒素污染監(jiān)控中大量樣本的篩檢。本研究以B細胞雜交瘤技術以能分泌抗總黃曲霉毒素單克隆抗體的雜交瘤細胞株為基礎，建立了檢測玉米、花生中總黃曲霉毒素的ELISA檢測方法，并初步研制出具有我國自主知識產(chǎn)權的ELISA試劑盒。1  材料與方法11  材料&#

5、160;111  主要儀器  CO2培養(yǎng)箱(美國Queue公司)；潔凈工作臺(北京半導體設備一廠)；生物倒置顯微鏡(日本歐林巴斯光學株式會社)；酶標分析儀(瑞士SUNRIS公司）；電子分析天平(瑞士Mettler公司)；低溫高速離心機(德國Hermle公司)；電泳儀(美國BIO-RAD公司）等。112  試劑  AFB1-BSA、黃曲霍毒素(B+G)(Aflatoxin B+G)、黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1）黃曲霉毒素B2(Aflatoxin B2，AFB2)、黃曲霉毒素G1(Aflatoxin G1，AFG1)、黃曲霉毒素G2(

6、Aflatoxin G2，AFG2)、T-2毒素(T-2toxin)、赭曲霉毒素A(OchratoxinA)、展青霉素(Patulin)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivslenol，DON)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)、匙孔嘁血藍素(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、伏馬菌素B1、抗體亞類測定試劑盒(IgM，IgG，IgA，IgD，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3)（美國Sigma公司）；RPMI1640培養(yǎng)基、選擇性培養(yǎng)基、福氏佐劑(完全、不完全)、二甲基亞砜(DMSO)、吐溫20(Tween20)、聚乙二醇(PEG，MW5000)、青霉素，鏈霉素(美圍G

7、ibco公司）；辣根過氧化物酶羊抗鼠IgG(北京中山試劑公司)；30H2O2(優(yōu)級純，北京化工廠)。113  溶液系統(tǒng)ELISA使用液  參考文獻3制備。114  細胞系與實驗動物  小鼠骨髓瘤細胞系Sp20由本室傳代，并經(jīng)8一氮雜鳥嘌呤處理。雌性BALBc小鼠，體重1820g(軍事醫(yī)學科學院實驗動物研究所動物繁育場)。115  抗總黃曲霉毒素雜交瘤細胞株  本研究室自制。12  方法 121  單克隆抗體生產(chǎn)  將抗總黃曲霉毒素雜交瘤細胞注入BALB/c小鼠腹腔，獲得含抗總黃曲霉毒素單克隆抗體

8、的腹水，并將所得腹水采用飽和硫酸銨鹽析法進行純化4。122  抗體特性鑒定  抗體的免疫球蛋白類別及亞類鑒定采用抗體亞類鑒定試劑盒；抗體的純度及分子量用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測定；IgG含量采用二喹呆甲酸（BCA）蛋白測定試劑盒進行測定；抗體滴度測定采用間接非競爭ELISA方法：以AFB1-BSA為包被抗原，從1：10000倍開始將抗體進行倍比稀釋，以Sp20細胞培養(yǎng)上清為陰性對照，以(A試驗-A空白)（A對照-A空白）21的最大稀釋倍數(shù)為滴定終點；抗體的特異性和抗體的靈敏度用間接競爭抑制性ELISA法進行測定，參試毒素為黃曲霉毒素B1、B2

9、、G1、G2、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、赭曲霉素A(OA)、伏馬菌素B1、T-2毒素和載體蛋白BSA。13  試劑盒各項技術參數(shù)研究 131  方法的檢出限(靈敏度)  用間接非競爭ELISA法作抗體滴度測定，找出合適的抗體工作濃度。再用間接競爭ELISA法作棋盤滴定，找出合適的包被濃度與毒素的競爭濃度，最后作標準曲線，確定線性范圍及檢出限。132  方法的回收率試驗  根據(jù)試劑盒的檢測范圍確定加標濃度，在不含黃曲霉毒素的玉米和花生樣品中分別進行高、低2個濃度的加標回收試驗，每個加標水平做5個重復的平行樣。樣品的提取方法為：樣品粉碎后使其90通過250500m網(wǎng)篩。稱取5g加到100ml具塞三角燒瓶中，加入05g NaCl及25ml甲醇水溶液(70：30，vv)，劇烈震蕩30min后過濾。濾液用純水稀釋10倍進行檢測。樣品中黃曲霉毒素濃度(gKg)=CDXW。式中：C-酶標板上測的黃曲霉毒素濃度(ngml)，根據(jù)標準曲線求得；D-樣品提取液的體積(ml)；X-稀釋倍數(shù)；W-樣品重量(g)。132  試劑盒穩(wěn)定性試驗  對試劑盒穩(wěn)定性采用37加速破壞實驗進行研究，將試劑盒分別放置于4和37，每隔24h進行ELISA測定，測定陰性對照(不加毒素B0