小葉榕葉總黃酮含量測(cè)定、鑒別及其對(duì)羥自由基清除作用的研究

1、小葉榕葉總黃酮含量測(cè)定、鑒別及其對(duì)羥自由基清除作用的研究         作者：劉力恒，王立升，王天文，劉雄民，楊曉青 【摘要】 目的探討小葉榕葉提取物中總黃酮的測(cè)定方法及其對(duì)羥自由基的清除能力。方法采用改進(jìn)的鋁鹽顯色分光光度法，在500nm 波長下，NaNO2-AlCl3-NaOH 為顯色劑，常溫顯色。結(jié)果20 min內(nèi)測(cè)定了小葉榕葉提取物中總黃酮的              

2、;            作者：劉力恒，王立升，王天文，劉雄民，楊曉青 【摘要】  目的探討小葉榕葉提取物中總黃酮的測(cè)定方法及其對(duì)羥自由基的清除能力。方法采用改進(jìn)的鋁鹽顯色分光光度法，在500nm 波長下，NaNO2-AlCl3-NaOH 為顯色劑，常溫顯色。結(jié)果20 min內(nèi)測(cè)定了小葉榕葉提取物中總黃酮的含量，回歸方程為A=0.013 6C-0.003 1，RSD=1.44%，相關(guān)系數(shù)為0.999 7，加標(biāo)回收率達(dá)到98.86%。結(jié)論該測(cè)定方法準(zhǔn)確、可靠，結(jié)果令人

3、滿意；提取液總黃酮含量的增加，對(duì)羥自由基的清除能力也增強(qiáng)。 【關(guān)鍵詞】  小葉榕；鑒別；羥自由基; 紫外分光光度法Abstract:ObjectiveTo establish a method for the determination of total flavonone from Ficusmver carpalf and study its scavenging activity on hydroxyl radicals.MethodsThe flavonoids in Ficus m icroearpa L. f. were determined by ultraviolet

4、 spectrophotometry at 500nm.ResultsThe correlation coefficient of the stand curve was 0.9997 and the relative standard deviation was 1.44%.Beer's law was obeyed in the range of 40360g·ml-1. The average recovery rate was 98.86%.ConclusionThe method is simple, accurate and reliable; the total

5、 flavonoids have scavenging capacity on hydroxyl radicals in a dependent manner.Key words:Ficus microcarpa L. f.;   Distinction;  Hydroxyl radicals;   UV Spectrophtometry    小葉榕葉為?？浦参镩艠銯icus microcarpa L. f . 的葉，異名落地金錢(本草求原) 。全世界榕樹有八百多種，主要分布在熱帶亞熱帶地區(qū)。我國榕屬植物約100

6、種，屬熱帶雨林的關(guān)鍵種類，主要分布在福建、廣東、廣西、海南、浙江和中國臺(tái)灣等地區(qū)，為當(dāng)?shù)氐闹饕参锲贩N之一。入藥主用其葉Folium Fici Microcarpae 。有研究表明18小葉榕葉中主要含黃酮、三萜類、齊墩果酸、脂肪族化合物和甾體化合物等。其中黃酮類和內(nèi)酯類等有效成分對(duì)治療冠心病、老年性癡呆、腦血栓、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和消除自由基、抗炎、抑菌、抗癌等方面有顯著效果,無毒副作用，并以此開發(fā)出多種藥品和保健食品9，10。    黃酮類( flavontes)化合物是植物光合作用產(chǎn)生的一大類化合物，已知的此類化合物約有二千多種，有以黃酮( 22苯基色酮)為母核的一

7、類黃色色素和黃酮的同分異構(gòu)體及其還原產(chǎn)物，還包括黃酮醇類、異黃酮類、兒茶素類、雙黃酮類及其衍生物。目前對(duì)銀杏類黃酮的研究較多，但對(duì)于榕樹黃酮類化合物的研究還相對(duì)比較缺乏。廣西是我國小葉榕產(chǎn)量最大的省份之一，而對(duì)于它的利用存在著深加工產(chǎn)品少、生產(chǎn)技術(shù)落后和資源不能合理利用等缺點(diǎn)。目前我國對(duì)小葉榕的利用只是處于起步階段，還未真正找到合理有效的利用途徑。雖然用小葉榕浸膏作為主成分的哮喘和慢性支氣管炎治療藥咳特靈膠囊已收載在部頒標(biāo)準(zhǔn)中，但小葉榕浸膏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中沒有詳細(xì)的質(zhì)量控制方法，僅僅是檢查其水不溶物和測(cè)定其浸出物，這樣的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不能準(zhǔn)確地反應(yīng)其量效關(guān)系，究其主要的原因，是沒有對(duì)其成分及其藥理活性進(jìn)行

8、深入地研究。    目前天然藥用植物中黃酮類化合物測(cè)定方法主要有紫外可見分光光度法11、高效液相色譜法12、薄層色譜法等1315。為此，本文采用改進(jìn)的鋁鹽顯色分光光度法測(cè)定了小葉榕葉醇提取物中總黃酮的含量并對(duì)其進(jìn)行了鑒別，并就該提取液對(duì)Fenton 體系產(chǎn)生的羥自由基的清除作用進(jìn)行了研究。1  器材    自然干燥的小葉榕樹葉、無水乙醇(AR)  ，2550紫外可見分光光度計(jì)(日本島津)，蘆丁對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所) 。RE-2000 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，SHB-循環(huán)式多用真空泵(鄭州長城科

9、工貿(mào)有限公司)。2  方法與結(jié)果2.1  小葉榕葉總黃酮成分提取研究小葉榕葉中黃酮類化合物提取方法時(shí)，一般采用溶劑直接提取后濃縮。而筆者在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，小葉榕葉中所含的脂溶性色素等物質(zhì)會(huì)使顯色法測(cè)定總黃酮時(shí)產(chǎn)生渾濁現(xiàn)象，造成很大誤差。因此，本實(shí)驗(yàn)采用石油醚脫脂，冷卻靜置后過濾除去葉綠素后再測(cè)定總黃酮的工藝。準(zhǔn)確稱取落地金錢干燥品200 g，70% 乙醇回流提取，過濾，回收乙醇，蒸至約100 ml，用100 ml石油醚萃取3次，萃取液低溫冷卻靜置48 h，過濾沉淀，萃取液蒸干得到粗提物。2.2  總黃酮的測(cè)定2.2.1  測(cè)定方法依據(jù)以蘆丁為對(duì)照品測(cè)定榕

10、樹葉中總黃酮的含量，加入鋁離子試劑，同時(shí)控制適宜pH值，使黃酮化合物與鋁鹽形成絡(luò)合物，在可見光區(qū)能獲得穩(wěn)定的特征吸收峰。2.2.2  對(duì)照品溶液制備精密稱取蘆丁對(duì)照品0.008 0 g , 60%乙醇定容至200 ml，制成40 g·ml-1 貯備液備用。2.2.3  供試品溶液制備將各正交實(shí)驗(yàn)所得提取液合并，回收濾液，每個(gè)樣品液中取0.5 ml加顯色劑60%乙醇定容至25 ml量瓶中，精密移取0.5 ml定容至10 ml量瓶中備用。2.2.4  最大吸收波長的選擇蘆丁標(biāo)樣顯色后掃描曲線如圖1所示；小葉榕黃酮提取物顯色后掃描曲線如圖2所示。小葉榕黃酮提取

11、物顯色后掃描曲線和蘆丁標(biāo)樣顯色后掃描曲線峰形相似，在500 nm 處吸收最大，且峰形對(duì)稱，故選擇K= 500 nm 為測(cè)定波長。2.2.5  標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別精密移取蘆丁對(duì)照品儲(chǔ)備液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0 ml，于25 ml溶量瓶中，入0. 50 mol·L-1NaNO2 溶液1.00 ml，搖勻，5 min 后，加入0. 30 mol·L-1AlCl3 溶液1.00 ml ，搖勻，加入1.00 mol·L-1NaOH 溶液5. 00 ml， 60% 乙醇水溶液定容至刻度，配制成系列蘆丁乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液。以蘆丁做參比，用

12、1cm比色皿在波長500 nm 處測(cè)其吸光度。以 吸光度值為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸，得方程A=0.013 6C-0.003 1，相關(guān)系數(shù)為0.999 7 如圖3。2.2.6  線性范圍的確定在相同體積下不同濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液在顯色稀釋后測(cè)定其吸光度見表1。從表1的數(shù)據(jù)可知當(dāng)顯色液中蘆丁乙醇標(biāo)準(zhǔn)濃度超過360 g·ml-1時(shí), 再增加蘆丁濃度，顯色液的吸光度幾乎無變化，故本方法選用較佳的線性范圍是顯色液中蘆丁標(biāo)準(zhǔn)濃度在40360 g·ml-1 之間。表1  蘆丁顯色液的測(cè)定數(shù)據(jù)（略）2. 2.7  顯色液的穩(wěn)定性本實(shí)驗(yàn)對(duì)經(jīng)鋁鹽顯色后的提取

13、液進(jìn)行了穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖4：顯色后顯色液在20 min 內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定，20 min 后顯色液吸光度開始下降，在空氣中，且強(qiáng)堿性條件下，黃酮類化合物很易被氧化, 隨時(shí)間延長吸光度下降，雖然從下降的絕對(duì)數(shù)值而言并不是很大，但相對(duì)的變化率已不可忽略，故最佳測(cè)定時(shí)間應(yīng)該顯色后20 min 內(nèi)完成。2.2.8  回收率實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確移取配制的地錢黃酮提取物待測(cè)溶液1.00 ml,7份，加對(duì)照品40g·ml-1蘆丁乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液1. 00 ml， 按“2.2.5”項(xiàng)下的方法操作，測(cè)定總黃酮含量，計(jì)算加標(biāo)回收率。結(jié)果見表2。從表2可以看出，總黃酮的平均回收率達(dá)到98.86%，說明所采用的測(cè)定

14、方法是可行的。表2  回收率實(shí)驗(yàn)（略）2.3  總黃酮的鑒別162.3.1  三氯化鋁反應(yīng)取樣品溶液點(diǎn)在濾紙上，滴加1%三氯化鋁乙醇溶液，吹干。在可見光下呈淡黃色，在紫外光下有明顯黃色熒光斑點(diǎn)。2.3.2  乙酸鎂反應(yīng)取樣品溶液點(diǎn)在濾紙上，滴加1%乙酸鎂甲醇溶液，加熱干燥，紫外光下呈黃褐色斑點(diǎn)。2.3.3  鹽酸一鋅粉反應(yīng)取乙醇提取液1 ml于試管中加入少許鋅粉振搖，加入幾滴濃鹽酸 (1次加入)，微熱，1min 后即呈紫紅色。2.4  小葉榕樹葉總黃酮提取物對(duì)羥自由基清除作用黃酮類化合物(Flavonoids)是多酚類物質(zhì)，是許多中草藥的有效成分。黃酮化合物由于結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)，是一類天然的抗氧化活性的物質(zhì)17，18，對(duì)超氧陰離子自由基(O-2·)、羥自由基(·OH)和單線態(tài)氧(1O2)有良好的清除作用。羥自由基(·OH)非?；顫姡?/p>