肝臟缺血再灌注損傷發(fā)生機制和預防

1、肝臟缺血再灌注損傷發(fā)生機制和預防    缺血再灌注損傷是由1960 年Jennings 首先提出的，是指組織器官缺血后再灌注，不僅不能使組織器官功能恢復，反而加重組織器官的功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷。缺血再灌注損傷在許多重要器官包括心、肝、肺、腎、胃腸道等均可發(fā)生。肝臟缺血再灌注損傷（HIRI）是肝臟外科手術(shù)中常見的病理過程，多見于休克、需要阻斷肝臟血流的肝外科手術(shù)以及肝移植術(shù)等病理生理過程中。其發(fā)生的病理生理機制復雜，有諸多因素參與其中，形成相互制約和相互促進的關(guān)系。包括炎性細胞浸潤和血小板聚集，反應性氧中間物（ROI）的產(chǎn)生和釋放、各種炎性介質(zhì)（如黏附分子和

2、白三烯）和血管活性物（如一氧化氮和內(nèi)皮素等產(chǎn)生有關(guān)）1。一 肝臟缺血再灌注損傷的發(fā)生機制1 反應性氧中間物（ROI）的產(chǎn)生和釋放：肝臟缺氧期間大量堆積的ATP代謝產(chǎn)物次黃嘌呤和氧發(fā)生反應。產(chǎn)生ROI（如過氧化物和高活性的羥基物）。由于ROI 在結(jié)構(gòu)上即其外軌道上有一個或多個不配對電子特點，因而使ROI 具有高度活性和潛在的毒性。肝臟缺血缺氧期間產(chǎn)生的ROI 可以通過以下幾個機制損傷細胞：選擇性地損傷相鄰分子如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸；增加信號傳遞，使嗜中性粒細胞產(chǎn)生趨化性和被激活；與NO 反應產(chǎn)生高度毒性的過氧化物2。大量的動物實驗和臨床病例證明ROI 不僅在再灌注期間明顯增加，且可持續(xù)24h 以上

3、，其產(chǎn)生的量與再灌注損傷呈正相關(guān)。2 炎性細胞的聚集在缺血再灌注損傷的組織中有中性粒細胞在損傷區(qū)域大量聚集和黏附，其聚集和黏附能力與白三烯B4(TB4)、血小板活化因子(platelet activating factor, PAF)、腫瘤壞死因子(-tumor necrosis, TNF-)、白介素1(IL-1)等表達有關(guān)34。聚集和黏附的中性粒細胞可通過以下機制損傷組織器官：聚集和黏附的中性粒細胞通過激活煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（彈力酶、蛋白酶和膠原酶）釋放增加蛋白溶解酶降解細胞外網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的所有成分，破壞完整細胞和使免疫球蛋白、補體和凝血因子失去活性；中性粒細胞釋放的彈力酶與ROI

4、可以相互作用，ROI 通過蛋氨酸氧化使彈力酶的抑制劑21抗胰蛋白酶失活；另外ROI 又可以由GMP-140 等黏附分子調(diào)節(jié)后，促使粒細胞黏附于微血管內(nèi)皮。因此，肝臟缺血再灌注損傷時，粒細胞、內(nèi)皮細胞黏附和ROI 之間的相互作用加重了組織結(jié)構(gòu)的損傷。3 血管活性物質(zhì)和缺血再灌注損傷3.1 一氧化氮：一氧化氮（NO）是能夠使粒細胞發(fā)生黏附作用的重要介質(zhì)，是由L精氨酸通過NO 合成酶合成的，其突出的作用是松弛血管平滑肌和抑制血小板聚集5-7。NO 可通過以下作用機制參與肝臟的缺血再灌注損傷：NO 可與ROI 競爭過氧化物歧化酶的介質(zhì)，形成過氧化氮物，引起血管收縮，形成再灌注損傷中竇狀隙血流停滯和無再

5、流的現(xiàn)象；NO 還可通過繼發(fā)性介質(zhì)cGMP 引起血管擴張，最終引起微循環(huán)的淤滯和再灌注損傷。3.2 內(nèi)皮素：內(nèi)皮素屬于血管活性肽族，可以分為ET-1、ET-2、ET-3 三種，其中ET-1 是最重要的血管收縮劑，可引起全身動脈和靜脈系統(tǒng)血管收縮。大量的實驗證明，ET-1 會導致肝臟竇狀隙收縮，血流減少，引起再灌注損傷中的無再流現(xiàn)象，且呈劑量依賴型。 3.3 血小板活化因子：血小板活化因子（PAF）是自身有效磷脂，具有血管活性和炎性介質(zhì)前體的特點，參與再灌注損傷。其作用機理主要是誘發(fā)血小板聚集和主要炎性細胞釋放各種蛋白酶和細胞因子等介質(zhì)。另外ROI 能通過增加內(nèi)皮細胞和血小板對鈣離子（激活的 P

6、LA2）的通透性促進內(nèi)皮細胞、粒細胞和血小板釋放PAF。3.4 白三烯：白三烯（LTB4）是花生四烯酸的代謝物，來源于Kupffer 細胞8，通過5-脂肪氧合酶途徑產(chǎn)生。白三烯在缺血再灌注損傷中明顯升高，參與肝臟缺血再灌注損傷。另外ROI 能通過增加細胞內(nèi)的自由鈣激活胞漿膜上的PLA2，而PLA2又能把細胞膜上的磷脂轉(zhuǎn)化為花生四烯酸增加白三烯的產(chǎn)物。 4 肝臟里不同細胞成分參與了肝臟缺血再灌注損傷4.1 Kupffer 細胞：已經(jīng)有研究證實，Kupffer 細胞參與缺血再灌注損傷，其具體的作用機理是Kupffer 細胞可以釋放大量的炎性介質(zhì)（IL-1 和IL-8），吸引中性粒細胞和產(chǎn)生ROI；

7、同時被激活的Kupffer 細胞能釋放TNF-，TNF-能誘發(fā)內(nèi)皮細胞釋放內(nèi)皮素1（ET-1），共同損傷器官組織9-11。在病理標本上表現(xiàn)為肝小葉中央?yún)^(qū)域周圍有明顯缺氧改變，電鏡顯示Kupffer 細胞有許多片層足和偽足。 4.2 星狀細胞：星狀細胞位于肝臟Disse 間隙內(nèi)皮細胞，環(huán)繞毛細血管，其功能是調(diào)節(jié)肝竇狀隙血流。肝再灌注損傷時，ET-1 和P 物質(zhì)等血管活性物質(zhì)可以使星狀細胞收縮，另外自由基也能激活星狀細胞，導致竇狀隙收縮，血流淤積、缺氧和進一步釋放炎性介質(zhì)，形成惡性循環(huán)，甚至產(chǎn)生原發(fā)性移植肝功能不良（primary graft dysfunction, PGD）或嚴重的原發(fā)性移植物

8、無功能（primary nofunction, PNF）。總之，在肝臟缺血和再灌注損傷中，有9 大因子起作用，即氧自由基、細胞因子、蛋白酶、鈣離子、磷脂酶A、花生四烯酸產(chǎn)物、血小板激活因子、內(nèi)皮素和內(nèi)毒素等12。這些因子并非獨立起作用，而是相互促進，構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)式或瀑布式樣反應，使肝臟缺血再灌注損傷機制尤為復雜13-14。結(jié)果是缺血再灌注激活了肝內(nèi)皮細胞，黏附因子（如 ICAM-1）的表達上調(diào)，炎性因子如TNF-等大量釋放，導致肝白細胞和內(nèi)皮細胞大量聚集，在激活細胞因子的作用下供體的免疫源性增加，甚至使移植物發(fā)生急性排斥反應；而慢性損傷肝組織在細胞因子和黏附因子的階梯式破壞反應下，發(fā)生細小血管的分

9、化、增生和硬化，發(fā)生慢性排斥反應最終導致移植物無功能15-16。二 肝臟缺血再灌注損傷的防治肝臟缺血再灌注損傷的預防可以從多個環(huán)節(jié)入手，包括術(shù)前、術(shù)中、術(shù)后靜脈用藥和在保存液中加入有效成分等，可以單一或多個環(huán)節(jié)共同調(diào)節(jié)預防。1 自由基清除劑：別嘌呤醇、谷胱甘肽（GSH）、維生素E、維生素C、輔酶Q10 等抗氧化劑，可以在氧化反應中提供電子給氧自由基，使氧自由基還原而被清除，減輕肝臟缺血再灌注損傷，可以有效地保護細胞膜和線粒體膜，保護肝功能。已經(jīng)有實驗證明，谷胱甘肽靜脈給藥可以作為抗氧化劑阻止大鼠肝臟移植后的缺血再灌注損傷17。N 乙酰半胱氨酸（NAC）作為GSH 的前體物質(zhì)，由于可以提高肝細胞

10、內(nèi)的GSH水平，起到類似GSH保護肝細胞膜、減輕肝臟缺血再灌注損傷后肝功能障礙的作用18。超氧化物歧化酶（SOD）是機體另外一種重要的氧自由基清除劑，能夠特異性地清除氧自由基，減少細胞凋亡，有效地保護肝功能。丙酮酸乙酯（EP）能夠通過有效地下調(diào)炎癥介質(zhì)，減少脂質(zhì)過氧化和抑制細胞凋亡而阻止肝臟缺血再灌注損傷19。硫普羅寧作為一種強有力的超氧化物合成抑制劑，已有實驗證明該藥對大鼠肝臟缺血再灌注損傷后的肝實質(zhì)有顯著的保護作用20。2 鈣通道阻滯劑：細胞內(nèi)鈣超載是肝臟發(fā)生缺血再灌注損傷的主要機制之一。因此，通過應用鈣拮抗劑可以通過誘導或抑制凋亡相關(guān)基因的表達而抑制細胞凋亡，降低肝組織中丙二醛、血清內(nèi)皮

11、素1、腫瘤壞死因子等水平，對肝臟缺血再灌注損傷有良好的保護作用。經(jīng)典的鈣拮抗劑維拉帕米和非選擇性鈣通道拮抗劑嗎多明均能有效阻止肝臟缺血再灌注損傷。另外，能抑制T 型和L 型鈣通道的粉防已堿（tetrandrine, TET）也能減輕大鼠肝臟缺血再灌注的脂質(zhì)過氧化和中性粒細胞浸潤21。3 蛋白酶抑制劑：如抑肽酶、烏司他丁、甲磺酸加貝酯（GM）等，可以通過抑制多形粒細胞聚集、黏附22，抑制微血管內(nèi)皮細胞氧自由基的釋放，抑制致炎細胞因子如TNF-和IL-6 等釋放23，減少細胞凋亡的發(fā)生，改善微血管灌注等機制有效地改善肝臟的缺血再灌注損傷，提高移植肝的存活率24。 4 中醫(yī)中藥的應用：參附注射液（S

12、F）是由中藥人參、附片提取物組成。其主要有效成份為人參皂甙和烏頭類生物堿。已經(jīng)有大量研究證實SF 對治療缺血再灌注損傷有明顯療效，其主要的作用機制可能為：清除機體氧自由基，防止鈣超載，抑制機體促炎性細胞因子 TNF-、IL-6 和IL-8 等的生成和釋放，減輕炎性反應25；抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-KB 的活性，下調(diào)炎癥因子的釋放26；保護內(nèi)皮細胞，促進內(nèi)皮釋放NO，擴張血管，改善微循環(huán)27；通過對凋亡相關(guān)基因Bax、bcl-2 和Fax 等的調(diào)控及促進HSP70 的表達，參與對缺血再灌注損傷的影響28-29。缺血再灌注損傷的病理機制非常復雜，SF 在各種研究中已經(jīng)顯示出對心、腎、腦、胃腸道等重要臟

13、器的缺血再灌注損傷的防治有重要的臨床意義30-31。SF 對肝臟缺血再灌注損傷也有成功的報導，動物實驗顯示該藥對大鼠移植肝臟缺血再灌注損傷有防治作用32。其可能作用機制包括抑制枯否氏細胞激活和氧自由基產(chǎn)生，改善微循環(huán)，減少細胞凋亡。另外銀杏提取物（ginkgo biloba extract, EGb），其主要成份為總黃酮類和銀杏內(nèi)酯，有獨特的抗氧自由基及調(diào)整循環(huán)穩(wěn)定，改善血液循環(huán)保護組織的作用33。已有研究EGb 對多種組織器官（心、腦、肝等）的缺血再灌注損傷具有保護作用34-36。其它中醫(yī)中藥如丹參和承氣方劑37也有改善肝臟能量代謝和抗氧自由基作用、保護線粒體的結(jié)構(gòu)和功能、抑制肝細胞凋亡和防

14、止細胞內(nèi)鈣超載，對減輕肝臟缺血再灌注損傷有良好的作用。5 物理療法：利用短暫的亞致死量的高溫療法，即稱為熱休克預處理可以防止多種臟器缺血時線粒體膜完整性的破壞并有助于線粒體在再灌注時產(chǎn)生高能磷酸化合物38，對保護肝細胞、防止細胞凋亡有重要的意義。Yamagami K 發(fā)現(xiàn)熱休克反應后能產(chǎn)生熱休克蛋白 HSP70，HSP70 能抑制氧自由基、脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)生，增加細胞的耐受力39；同時熱休克反應能促進機體內(nèi)源性抗氧化物觸酶的產(chǎn)生40。另外一種物理療法即通過臭氧氧化預處理，可以提升內(nèi)源性NO 濃度和維持細胞氧化還原平衡狀態(tài)來保護肝臟，避免缺血再灌注損傷，對日益增加的肝臟移植手術(shù)有重要的臨床意義。6

15、 新型免疫抑制劑的應用：新型和高效的器官移植免疫抑制劑 FK506 是一種從鏈霉素中分離出來的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。有研究證明，F(xiàn)K506 可以通過抑制了NF-KB 與其靶基因啟動子特異序列的結(jié)合活性，抑制靶基因的表達；同時抑制促炎因子TNF-、IL-1、ICAM-1 等的產(chǎn)生，抑制中性粒細胞在病灶區(qū)的聚集。如Okano41等發(fā)現(xiàn) FK506 可增加肝臟低溫保存再灌注的血流，增加組織ATP 含量。Carcia-Criad42等研究證明，F(xiàn)K506 可以減低熱缺血再灌注肝臟氧自由基含量，抑制細胞因子的釋放和中性粒細胞的浸潤能力。而國內(nèi)趙浩亮43等研究在肝臟保存液和灌注液中加入FK506，顯示用藥組E

16、T 含量下降，ALT 下降，肝細胞和肝竇內(nèi)皮細胞形態(tài)異常減輕。另外 FK506 可以移植肝臟保存液中TNF-mRNA 的表達，使TNF- mRNA 表達減少44-45，故此FK506 是一種新型高效的預防肝臟缺血再灌注損傷的藥物。7 基因治療：隨著干細胞和分子生物學的發(fā)展以及對肝臟內(nèi)皮細胞在缺血再灌注損傷中的認識，基因敲除技術(shù)被用于缺血再灌注損傷的防治。其作用機理是清除有害基因，抑制內(nèi)皮細胞的活化，減輕炎癥反應的程度，從而減輕缺血再灌注損傷。Lehmann46等用腺病毒轉(zhuǎn)載Cu/Zn-SOD 基因至大鼠供肝中，行肝移植后轉(zhuǎn)基因大鼠全部存活。而Ichihara47等證實人視網(wǎng)膜母細胞瘤（Rb）轉(zhuǎn)基因小鼠在肝臟表達 Rb 蛋白后有抗凋亡作用。也有研究48發(fā)現(xiàn)用CD40Ig 進行靶向基因治療可以發(fā)揮抗氧化劑HO-1 和抗凋亡Bcl-2/Bcl-X1 的表達，有效保護缺血再灌注損傷的大鼠肝臟。另外一項研究49發(fā)現(xiàn)通過腺病毒轉(zhuǎn)染絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，可以阻止凋亡細胞的死亡和隨后的缺血再灌注損傷，提高肝細胞的存活率。 8 其它治療：其它還有許多藥物正在試驗中，如鈉鉀通道拮抗劑奎尼丁等，可以提高缺血肝臟ADP 和總腺苷水平。細胞因子釋放抑制劑可以抑制