轉(zhuǎn)座子(真核)

1、第二節(jié)第二節(jié)細(xì)菌轉(zhuǎn)座因子的轉(zhuǎn)座機(jī)制、遺傳效應(yīng)和應(yīng)用細(xì)菌轉(zhuǎn)座因子的轉(zhuǎn)座機(jī)制、遺傳效應(yīng)和應(yīng)用一、轉(zhuǎn)座因子的插入機(jī)制一、轉(zhuǎn)座因子的插入機(jī)制 轉(zhuǎn)座因子不同于噬菌體和質(zhì)粒，它們不是獨(dú)立的復(fù)制子，不能獨(dú)立存在。所有轉(zhuǎn)座因子，包括插入序列、復(fù)合轉(zhuǎn)座子、TnA及Mu噬菌體等的轉(zhuǎn)座機(jī)制都很相似。 轉(zhuǎn)座因子插入到一個(gè)新的部位的通常步驟是：1.在靶DNA序列兩側(cè)各一條單鏈上造成一個(gè)切口，切口之間的距離決定了將來(lái)轉(zhuǎn)座子兩側(cè)正向重復(fù)單位的長(zhǎng)度。2.轉(zhuǎn)座子插入帶有與突出單鏈末端的切口之間，二者共價(jià)連接起來(lái)，3.由此形成的兩段靶序列單鏈區(qū)由DNA聚合酶或其它類似的酶填充，再由連接酶將端口連接起來(lái)。交錯(cuò)末端的產(chǎn)生和填充解釋了

2、在插入部位產(chǎn)生靶DNA正向重復(fù)的原因。 二、轉(zhuǎn)座模型二、轉(zhuǎn)座模型根據(jù)轉(zhuǎn)座因子在轉(zhuǎn)座過(guò)程中是否有共整合體及轉(zhuǎn)座因子是否有復(fù)制而分為二種類型：復(fù)制型轉(zhuǎn)座和非復(fù)制型轉(zhuǎn)座；又可根據(jù)轉(zhuǎn)座過(guò)程的不同，而分為剪-貼型轉(zhuǎn)座、保守型轉(zhuǎn)座和復(fù)制型轉(zhuǎn)座等。1.復(fù)制型轉(zhuǎn)座復(fù)制型轉(zhuǎn)座(replicativetransposition)(1)供體分子上的轉(zhuǎn)座子首先被轉(zhuǎn)座酶在其兩端被交錯(cuò)切開(kāi)，使轉(zhuǎn)座子的兩個(gè)DNA鏈都帶有游離的3末端OH基。(2)轉(zhuǎn)座酶在轉(zhuǎn)座子兩端進(jìn)行切割的同時(shí)也對(duì)靶部位的兩個(gè)鏈進(jìn)行交錯(cuò)切割，(3)供體和靶鏈在切口處連接，轉(zhuǎn)座子的每個(gè)DNA鏈的3末端OH基與靶位點(diǎn)切割后產(chǎn)生的突出單鏈5末端磷酸基團(tuán)共價(jià)連接，

3、從而產(chǎn)生一種交叉結(jié)構(gòu)。 (4)在交叉結(jié)構(gòu)中，其交錯(cuò)末端都含有單鏈區(qū)，此單鏈區(qū)是為DNA合成提供模板的假?gòu)?fù)制叉(pseudoreplication forks),如果復(fù)制從二個(gè)假?gòu)?fù)制叉繼續(xù)進(jìn)行，那么將通過(guò)轉(zhuǎn)座子并在其末端終止，從而形成二個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)座子。(5)復(fù)制可能是由宿主編碼的功能完成的。供體和受體形成的這種結(jié)構(gòu)稱為共整合體(cointegrate)，所謂共整合體，就是兩個(gè)或兩個(gè)以上的復(fù)制子通過(guò)共價(jià)連接起來(lái)的。共整合體在原來(lái)兩個(gè)分子之間結(jié)合處含有兩個(gè)轉(zhuǎn)座子的拷貝，方向?yàn)檎蛑貜?fù)。(6) 然后，二個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)座子之間可通過(guò)解離酶在專一位點(diǎn)進(jìn)行的專一位點(diǎn)重組而將二個(gè)分子分開(kāi)(圖11 ) 2.非復(fù)制型

4、轉(zhuǎn)座非復(fù)制型轉(zhuǎn)座(nonreplicativetransposition)根據(jù)在轉(zhuǎn)座過(guò)程中有無(wú)交叉結(jié)構(gòu)，而分為下面兩種不同的類型。(1)剪剪-貼型轉(zhuǎn)座貼型轉(zhuǎn)座(cut-and-pastetransposition) 這類轉(zhuǎn)座又叫簡(jiǎn)單插入，是一種非復(fù)制型轉(zhuǎn)座過(guò)程。* 在該過(guò)程中轉(zhuǎn)座酶識(shí)別轉(zhuǎn)座因子的末端，在轉(zhuǎn)座因子的末端進(jìn)行雙鏈切割，* 同時(shí)轉(zhuǎn)座酶在受體的靶部位交錯(cuò)切割，然后轉(zhuǎn)座子與靶部位的切口末端相連接。而且，在轉(zhuǎn)座子過(guò)程中，轉(zhuǎn)座因子并不與受體形成共整合體。這種類型的轉(zhuǎn)座只需要轉(zhuǎn)座酶。* 很多插入序列(IS)和復(fù)合型轉(zhuǎn)座子，如IS10、IS50、Tn5、Tn10等就是以這種途徑進(jìn)行轉(zhuǎn)座的。 圖1

5、2(2)保守型轉(zhuǎn)座保守型轉(zhuǎn)座(consertivetransposition)這種轉(zhuǎn)座屬于非復(fù)制型轉(zhuǎn)座，但是在轉(zhuǎn)座過(guò)程中有同復(fù)制型轉(zhuǎn)座過(guò)程中類似的交叉結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)，但不形成共整合體。轉(zhuǎn)座子被插入到受體的靶位點(diǎn)DNA中，并且其兩側(cè)為由原來(lái)的單鏈切口所產(chǎn)生的重復(fù)序列。供體DNA在原來(lái)轉(zhuǎn)座子處留下一個(gè)大的缺口。有些插入序列和轉(zhuǎn)座子是以這種方式進(jìn)行轉(zhuǎn)座。 三、轉(zhuǎn)座子的遺傳效應(yīng)三、轉(zhuǎn)座子的遺傳效應(yīng)轉(zhuǎn)座因子能引起許多遺傳變異，如插入突變和基因重排等，是生物進(jìn)化的一種主要原動(dòng)力之一。(一一)插入突變插入突變各種IS、Tn轉(zhuǎn)座子都可以引起插入突變。當(dāng)它們插入到一個(gè)基因時(shí)，該基因的功能受到破壞，其表型和一般突變體

6、相同，如營(yíng)養(yǎng)缺陷型、酶活性喪失等。如果插入的是Tn轉(zhuǎn)座子，則由于Tn轉(zhuǎn)座子總是帶有抗藥性基因，所以轉(zhuǎn)座子插入引起的基因突變有兩個(gè)表型效應(yīng)，即基因突變的表型效應(yīng)和轉(zhuǎn)座子帶來(lái)的抗藥性。(二二)DNA重排重排(缺失、擴(kuò)增和倒位缺失、擴(kuò)增和倒位)當(dāng)轉(zhuǎn)座因子插入某一基因后，一方面引起該基因的失活，另方面也引起插入部位鄰近片段的不穩(wěn)定而產(chǎn)生缺失，該現(xiàn)象首先在IS1中發(fā)現(xiàn)。以后在IS2、Tn3、Tn9等轉(zhuǎn)座因子中都發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象。缺失發(fā)生的原因推測(cè)是首先轉(zhuǎn)座子以相同方向轉(zhuǎn)座到鄰近位置上，在兩個(gè)正向重復(fù)轉(zhuǎn)座因子之間發(fā)生同源重組，就導(dǎo)致宿主染色體DNA缺失。如果轉(zhuǎn)座因子以相反方向轉(zhuǎn)座到鄰近位置上，然后發(fā)生重組，

7、則引起染色體DNA倒位 (見(jiàn)圖見(jiàn)圖14)。由于轉(zhuǎn)座因子的存在而促使發(fā)生倒位的現(xiàn)象在Mu、IS1等轉(zhuǎn)座因子中都有報(bào)道同樣，由于轉(zhuǎn)座子之間的同源重組，可使兩個(gè)不同的DNA片段連接在一起，從而引起DNA的擴(kuò)增。由于轉(zhuǎn)座作用，使一些原來(lái)在染色體上相距甚遠(yuǎn)的基因組合到一起，構(gòu)建成一個(gè)操縱子或表達(dá)單元，也可能產(chǎn)生一些具有新的生物學(xué)功能的基因和新的蛋白質(zhì)分子。 (三三)極性效應(yīng)極性效應(yīng)* 與轉(zhuǎn)座因子有關(guān)的另一個(gè)特殊現(xiàn)象是它們的插入極性效應(yīng)，即當(dāng)轉(zhuǎn)座因子插入到一個(gè)操縱子的前端基因時(shí)，不僅能破壞被插入的基因，而且也能大大降低位于遠(yuǎn)離啟動(dòng)子一端的基因的表達(dá)。* 現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)轉(zhuǎn)座因子都有極性效應(yīng)，而且正、反向插

8、入時(shí)都有這種現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)，在IS的所有可閱讀框內(nèi) (IS1除外)，包含有依賴于Rho的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和終止密碼子，這是造成極性突變的根本原因。四、轉(zhuǎn)座子的應(yīng)用四、轉(zhuǎn)座子的應(yīng)用-轉(zhuǎn)座子誘變轉(zhuǎn)座子誘變 用于誘變的轉(zhuǎn)座子一般都是復(fù)合型轉(zhuǎn)座子，如：Tn5、Tn9、Tn10等。其中用的較多的是Tn5。Tn5具有轉(zhuǎn)座頻率高，對(duì)目標(biāo)序列特異性要求低，且轉(zhuǎn)座不需與細(xì)菌的基因組存在同源性等優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛用于許多革蘭氏陰性菌的轉(zhuǎn)座子誘變中。利用轉(zhuǎn)座子可進(jìn)行隨機(jī)誘變和定位誘變。第三節(jié)第三節(jié)反轉(zhuǎn)錄病毒反轉(zhuǎn)錄病毒一、反轉(zhuǎn)錄病毒的生活周期反轉(zhuǎn)錄病毒的生活周期* 反轉(zhuǎn)錄病毒是一類單鏈RNA病毒，它們所含有的基因組RNA是

9、在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，經(jīng)過(guò)雙鏈DNA中間體，而后再行復(fù)制的。* 病毒的生活周期中有一個(gè)和轉(zhuǎn)座類似的過(guò)程，使雙鏈DNA插入到宿主基因組，并使DNA靶位點(diǎn)產(chǎn)生短的正向重復(fù)序列。二、反轉(zhuǎn)錄病毒的基因組和反轉(zhuǎn)錄中雙鏈二、反轉(zhuǎn)錄病毒的基因組和反轉(zhuǎn)錄中雙鏈DNA的合成的合成1.反轉(zhuǎn)錄病毒基因組反轉(zhuǎn)錄病毒基因組反轉(zhuǎn)錄病毒基因組RNA的長(zhǎng)度為58 kb?；蚪MRNA的中部帶有g(shù)ag，Pol與env 三個(gè)“基因”，“基因”這一術(shù)語(yǔ)在這里表示為編碼區(qū)，每一編碼區(qū)通過(guò)加工實(shí)際上產(chǎn)生出多種蛋白質(zhì)。一個(gè)含3個(gè)基因的反轉(zhuǎn)錄病毒其基因的排列方式為gag-pol-env。其中g(shù)al基因編碼病毒粒子核心結(jié)構(gòu)蛋白成份，包括核酸結(jié)合

10、蛋白；pol基因編碼反轉(zhuǎn)錄酶、整合酶和蛋白酶；env基因編碼病毒外膜蛋白?；蚪M本身在兩端各有一個(gè)有完全相同的長(zhǎng)度為1080 bp的稱為R的正向重復(fù)序列。在兩個(gè)R片段的內(nèi)側(cè)，5端有一個(gè)80100堿基長(zhǎng)的U5順序(unique to the 5end)， 3端則有一個(gè)1701250堿基長(zhǎng)的U3順序(unique to the 3end)。反轉(zhuǎn)錄病毒侵染細(xì)胞后，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以病毒基因組RNA為模板，合成雙鏈DNA分子。象其它DNA聚合酶一樣，反轉(zhuǎn)錄酶也需要一個(gè)引物，一般病毒顆粒中攜帶的宿主提供的tRNA作為天然引物。雙鏈原病毒DNA的分子長(zhǎng)度要比轉(zhuǎn)錄前的單鏈 RNA分子長(zhǎng)一些，這是由于在反

11、轉(zhuǎn)錄的過(guò)程中，在DNA鏈的5端增加了U3，在3端增加了U5，產(chǎn)生了兩個(gè)完全相同的正向重復(fù)序列U3RU5，稱為長(zhǎng)末端重復(fù)序列LTR(long terminal repeats)。在長(zhǎng)末端重復(fù)序列中有著轉(zhuǎn)錄起始信號(hào)和3端切斷并加poly(A)尾巴的信號(hào)。二、絲狀真菌中的轉(zhuǎn)座因子二、絲狀真菌中的轉(zhuǎn)座因子* 自從1989年首次在脈孢霉菌中發(fā)現(xiàn)Tad轉(zhuǎn)座因子以來(lái)，已經(jīng)先后從尖胞鐮刀菌、白粉病菌、稻瘟病菌、曲霉菌等不同的真菌中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座因子。* 絲狀真菌中的轉(zhuǎn)座因子種類繁多，大小差異也較大。有些屬于LTR-反轉(zhuǎn)座子類型中的Copia組或Gypsy組的，有些屬于非-LTR反轉(zhuǎn)座子中的LINE組或SINE組的，

12、有些則屬于DNA轉(zhuǎn)座子(圖 )。* 含有轉(zhuǎn)座因子的這些真菌大多是屬于植物病原真菌、工業(yè)真菌或直接從田間分離的真菌，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)保存的菌株很少有轉(zhuǎn)座因子；另外這些真菌的遺傳變異較大，但一般都不能進(jìn)行有性生殖。 真菌中轉(zhuǎn)座因子的鑒定，一般是通過(guò)下面四種方法：(1)克隆真菌中的重復(fù)序列，然后通過(guò)與其它生物中的已知轉(zhuǎn)座因子進(jìn)行比較來(lái)進(jìn)行確定。(2)根據(jù)真菌的缺陷型表型來(lái)鑒定轉(zhuǎn)座因子，這是一種最可靠的方法。如尖胞鐮刀菌的一個(gè)轉(zhuǎn)座因子就是在硝酸還原酶突變體中鑒定出來(lái)的，該突變體就是由于轉(zhuǎn)座因子的插入而引起突變的。(3)通過(guò)同源雜交，即以別的生物中的轉(zhuǎn)座因子為特征進(jìn)行雜交篩選。(4)通過(guò)DNA序列分析。 (一一

13、)反轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)座子 反轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座過(guò)程是以RNA為中間體。根據(jù)反轉(zhuǎn)座子的兩端是否具有類似反轉(zhuǎn)錄病毒原病毒的長(zhǎng)末端重復(fù)序列LTR而分為兩種類型：LTR-反轉(zhuǎn)座子(LTR-retrotransposon)和非LTR-反轉(zhuǎn)座子(non LTR-retrotransposon)。它們的共同特征是在轉(zhuǎn)座過(guò)程中，即要經(jīng)過(guò)一個(gè)RNA階段，再經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成DNA后插到靶位上。1.LTR-反轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)座子(LTR-retrotransposon) LTR-反轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)類似于反轉(zhuǎn)錄病毒，與反轉(zhuǎn)錄病毒的主要區(qū)別是反轉(zhuǎn)座子不具有侵染性和不帶有病毒外膜基因(env)。 反轉(zhuǎn)座子的特征是具有長(zhǎng)的末端正向重復(fù)序列(LTR)，

14、中央含有13個(gè)大的閱讀框架。反轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)中的gag編碼核酸結(jié)合蛋白，pol編碼蛋白酶(PR)、整合酶(IN)、反轉(zhuǎn)錄酶(RT)及RNase H(RH)。 根據(jù)pol中的基因產(chǎn)物順序，又可將LTR-反轉(zhuǎn)座子分為兩個(gè)組：Copia組和Gypsy組。Gypsy組，其編碼區(qū)的結(jié)構(gòu)類似于反轉(zhuǎn)錄病毒，其“env”區(qū)的位置與反轉(zhuǎn)錄病毒的相同，但其核酸序列卻與反轉(zhuǎn)錄病毒的env序列不同。這類轉(zhuǎn)座子包括：果蠅中的copia和gypsy，酵母的Ty，嚙齒動(dòng)物的IAP和VL30，人類的THE，玉米的BS1。絲狀真菌中的很多轉(zhuǎn)座因子都屬于這個(gè)類群，如：Foret(尖孢鐮刀菌)、Skippy(尖孢鐮刀菌)、CfT-1(

15、黃枝孢菌)、Maggy(稻瘟病菌)、Boty(灰葡萄孢菌)、Afult1(煙曲霉)等。絲狀真菌中的這些反轉(zhuǎn)座子大多都屬于gypsy組，具有pol和gag兩個(gè)閱讀框架。 如尖孢鐮刀菌中的Skippy，長(zhǎng)度為7846 bp，末端有2個(gè)正向重復(fù)的LTR (429 bp)，在靶位點(diǎn)產(chǎn)生5 bp的正向重復(fù)。中間有2個(gè)ORF，第1個(gè)ORF的長(zhǎng)度為2562 bp，與反轉(zhuǎn)錄病毒的gag基因有同源性，第2個(gè)ORF的長(zhǎng)度為3888 bp，與反轉(zhuǎn)錄病毒pol基因編碼的反轉(zhuǎn)錄酶、蛋白酶和RNase H有同源性，其排列順序與Gypsy組相同。其它一些真菌LTR-反轉(zhuǎn)座子見(jiàn)表4 。表4 一些真菌中的LTR-反轉(zhuǎn)座子 LT

16、R-反轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)座子 長(zhǎng)度(bp) LTR 靶序列重復(fù) 拷貝數(shù) 寄主來(lái)源 Gypsy組： Foret 8000 不詳 不詳 多拷貝 尖胞鐮刀菌(F. oxysporum) Skippy 7846 429 5 多拷貝 尖胞鐮刀菌(F. oxysporum) CfT-1 6968 427 5 25 黃枝胞菌(Cladosporium fulvum) Maggy 5638 253 ? 多拷貝 稻瘟病菌(Magnaporthe grisea) Boty 6000 596 ? 多拷貝 灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea) Afult1 6914 282 5 多拷貝 煙曲霉(Aspergillu

17、s fumigatus) Mars4 2Copia組： Mars3 5800 不詳 不詳 60 Ascobolus 2.非非LTR-反轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)座子(NonLTR-retrotransposon)這類反轉(zhuǎn)座子在結(jié)構(gòu)上與反轉(zhuǎn)錄病毒有很大的不同。這類反轉(zhuǎn)座子包括哺乳動(dòng)物的LINE和SINE，玉米的Cin4及真菌中的一些轉(zhuǎn)座因子等。它們沒(méi)有長(zhǎng)末端重復(fù)序列，但大多數(shù)在3末端具有富含腺嘌呤(A)的順序。在轉(zhuǎn)座時(shí)，使靶位點(diǎn)產(chǎn)生721 bp的正向重復(fù)。(1)LINE 這是一類拷貝數(shù)很多、序列很長(zhǎng)的反轉(zhuǎn)座子，叫做長(zhǎng)散布重復(fù)序列(long interspersed repeated sequences)，簡(jiǎn)稱L

18、INE。 哺乳動(dòng)物基因組包含2萬(wàn)5萬(wàn)個(gè)被稱為L(zhǎng)1的LINE1序列，長(zhǎng)67kb，3末端有富含A的序列，L1含有兩個(gè)14bp重疊的各長(zhǎng)1137bp和3900 bp的開(kāi)放閱讀框架，第1個(gè)ORF是RNA結(jié)合蛋白，第2個(gè)ORF編碼反轉(zhuǎn)錄酶(RT)。LINE在靶位點(diǎn)具有正向重復(fù)序列 對(duì)L1的研究表明，LINE的轉(zhuǎn)座是通過(guò)RNA中間體進(jìn)行的，其機(jī)理是：在RNA聚合酶的作用下從L1的5開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，RNA聚合酶在遇到一串T后終止轉(zhuǎn)錄，結(jié)果是轉(zhuǎn)錄出的RNA在3含有一串U，如果這個(gè)轉(zhuǎn)錄物RNA的末端回折，則U與A配對(duì)，可作為反轉(zhuǎn)錄酶的引物合成cDNA；接著以cDNA為模板合成雙鏈L1 DNA，然后通過(guò)一種未知的方式插

19、入到寄主DNA中(圖27 )。 圖27絲狀真菌中的轉(zhuǎn)座子：Tad(粗糙脈胞菌)、Palm(尖胞鐮刀菌)、CgT1(盤長(zhǎng)孢狀刺盤孢菌)、Mars1( )等，都屬于LINE組的反轉(zhuǎn)座子(表6)。 在粗糙脈孢菌的基因組中，存在多拷貝的Tad因子。Tad的長(zhǎng)度為7000 bp，兩端沒(méi)有重復(fù)序列，在靶位點(diǎn)有14或17bp的正向重復(fù)序列。Tad有兩個(gè)ORF，ORF1和ORF2與LINE組的ORF1和ORF2有同源性，其中ORF2具有反轉(zhuǎn)錄酶(RT)的特征。 1993年，Kinsey將粗糙脈孢菌中am(谷氨酸脫氫酶)基因中的66bp長(zhǎng)的內(nèi)含子，人工構(gòu)建到Tad的ORF1上，然后將其引入到不含Tad的菌株中，

20、結(jié)果發(fā)現(xiàn)Tad的轉(zhuǎn)錄物中缺少內(nèi)含子，說(shuō)明Tad的轉(zhuǎn)座經(jīng)過(guò)RNA/cDNA中間階段的加工，也說(shuō)明Tad是屬于反轉(zhuǎn)座子。 表6 絲狀真菌中非 LTR-反轉(zhuǎn)座子的特征 非 LTR-反轉(zhuǎn)座子 長(zhǎng)度 靶序列正向重復(fù) 拷貝數(shù) 來(lái)源 LINE組 Tad 7000 14/17 多拷貝 粗糙脈胞菌(N. crassa) Palm 不詳 不詳 不詳 尖胞鐮刀菌(F. oxysporum) CgT1 5700 13 30 盤長(zhǎng)孢狀刺盤孢菌(Colletotrichum gloeosporiodes) Mars1 ? ? 60 Ascobolus SINE組 MGSR1 800 ? 分散在基因組中 稻瘟病菌 M. g

21、riseaMg-SINE 470 ? 100 稻瘟病菌 M. grisea Nrs1 500-600 ? 分散在基因組中 Nectria haematococca Eg-R1 700 ? 50 小麥白粉菌(Erysiphe graminis) EGH 903 13 分散在基因組 小麥白粉菌(Erysiphe graminis) (2)SINE 這類反轉(zhuǎn)座子最先在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)，后來(lái)在真菌中也發(fā)現(xiàn)這類反轉(zhuǎn)座子。SINE一般都比較短，大約70300bp，但是拷貝數(shù)極高，通常在10萬(wàn)以上。這些反轉(zhuǎn)座子稱為短散布重復(fù)序列(short interspersed repeated sequences)，簡(jiǎn)

22、稱SINE。SINE的特征是：具有RNA聚合酶啟動(dòng)子，3末端有850 bp 多聚A尾巴，兩端具有721bp正向重復(fù)序列，中間沒(méi)有ORF，轉(zhuǎn)座時(shí)需要經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)座過(guò)程。表7 LINE組和SINE組反轉(zhuǎn)座子的主要區(qū)別 長(zhǎng)度(bp) 主要ORF RNA聚合酶 多聚A 同源性 SINE 500 No Yes 7SL RNA or tRNA LINE 5-7000 Yes Yes Reverse transcriptase 人類的Alu家族可以作為SINE的代表。Alu因子長(zhǎng)約300 bp，在人類基因組中約有50萬(wàn)個(gè)拷貝，占人類基因組的5%6%。Alu因子是因?yàn)樵撈沃杏邢拗菩詢?nèi)切酶Alu位點(diǎn)而被稱為Alu

23、因子的。 Alu因子與7SL RNA(長(zhǎng)度為294 bp)非常相似，7SL RNA是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)核糖體蛋白粒子(信號(hào)識(shí)別粒子)的一部分，幫助新生的多肽從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中分泌出來(lái)。7SL RNA在果蠅、老鼠和人中都高度保守。最近對(duì)大腸桿菌中的小分子RNA(100 bp)的序列分析表明，與7SL RNA具有相似性。 Alu因子和7SL RNA都具有兩個(gè)RNA聚合酶啟動(dòng)子。在Alu的3端，有一串A，Alu因子的兩端是正向重復(fù)序列。正向重復(fù)序列的3下游有一串T，是RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)。Alu的位置沒(méi)有固定場(chǎng)所，可以出現(xiàn)在基因的5或3，也可出現(xiàn)在外顯子區(qū)和內(nèi)含子區(qū)。 SINE的反轉(zhuǎn)座機(jī)理與L1類似，其反轉(zhuǎn)座過(guò)

24、程是利用LINE的反轉(zhuǎn)錄酶和其它蛋白。 絲狀真菌中也有很多這種SINE類型的反轉(zhuǎn)座子，如：MGSR1(稻瘟病菌)、Mg-SINE(稻瘟病菌)、Nrs1( )、Eg-R1(小麥白粉菌)、EGH(小麥白粉菌)等。稻瘟病菌中的Mg-SINE屬于SINE類型的轉(zhuǎn)座因子，長(zhǎng)度為472bp，具有A和B兩個(gè)RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)，末端具有8-50 bp的多聚A，中間無(wú)ORF，兩端有長(zhǎng)度為16 bp的正向重復(fù)序列，其在寄主基因組中的拷貝數(shù)是100。根據(jù)其序列推測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)也象tRNA那樣，具有三葉草型的二級(jí)結(jié)構(gòu)(表 6)。 (二二)DNA轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子(DNAtransposon)*這是真核生物中的第二類轉(zhuǎn)座子，

25、它們通過(guò)DNA-DNA方式轉(zhuǎn)座。*根據(jù)它們的結(jié)構(gòu)，可以分為兩個(gè)組：第一組包括果蠅的P因子，玉米的Ac/Ds和Spm/En因子，金魚草(Antirrbinum majus)中的Tam， Caenorhaditis elegans中的Tc1，及真菌中的很多因子。它們?cè)趦啥硕加卸痰姆聪蛑貜?fù)序列，中間有編碼轉(zhuǎn)座酶的閱讀框架，其轉(zhuǎn)座機(jī)制不太清楚，它們可能是通過(guò)復(fù)制性轉(zhuǎn)座機(jī)制進(jìn)行轉(zhuǎn)座。* 第二組包括果蠅的FB(fold-back)，F(xiàn)B成員的長(zhǎng)度在5005000 bp，具有長(zhǎng)度不同的末端反向重復(fù)序列。一些FB因子的兩個(gè)末端反向重復(fù)序列緊靠在一起，中間無(wú)間隔；另一些則在反向重復(fù)序列之間含一個(gè)非重復(fù)性的DNA

26、區(qū)。已有證據(jù)表明，任何DNA序列，只要其兩側(cè)有FB成分，都可以發(fā)生轉(zhuǎn)座。這種轉(zhuǎn)座，往往涉及很大的DNA區(qū)段(可達(dá)200 kb)。FB的轉(zhuǎn)座行為非常類似于細(xì)菌中的復(fù)合轉(zhuǎn)座子，但其真正的轉(zhuǎn)座機(jī)制還不清楚，可能是通過(guò)DNA-DNA方式轉(zhuǎn)座。*很多絲狀真菌的轉(zhuǎn)座因子也屬于這一類.*尖胞鐮刀菌中類似細(xì)菌的轉(zhuǎn)座子有：Fot1、Fot2、Impala、Hop等(表8 )。它們的特征與細(xì)菌轉(zhuǎn)座子類似，在轉(zhuǎn)座子的兩端是長(zhǎng)度為2796 bp的反向重復(fù)序列，中間可能是一個(gè)編碼轉(zhuǎn)座酶的開(kāi)放閱讀框架，在寄主的靶位點(diǎn)有27 bp的正向重復(fù)序列，這四個(gè)轉(zhuǎn)座子的大小依次為：1928 bp、2100 bp、3500 bp和12

27、80 bp。Fot1、Fot2、Impala、Hop這4個(gè)轉(zhuǎn)座子都是通過(guò)對(duì)野生型菌株和硝酸還原酶缺陷型突變菌株中的硝酸還原酶基因(nia)進(jìn)行比較而鑒定出來(lái)的。*將煙曲霉(A. nidulans)的硝酸還原酶基因(niaD)轉(zhuǎn)移到尖胞鐮刀菌硝酸還原酶缺陷型中則可恢復(fù)其硝酸還原酶的功能。 表8 一些真菌中的DNA轉(zhuǎn)座子 轉(zhuǎn)座子 大小 IR 靶序列重復(fù) 拷貝數(shù) 來(lái)源 Fot1 1928 44 2 100 尖胞鐮刀菌(F. oxysporum) Fot2 2100 66 2 100 尖胞鐮刀菌(F. oxysporum) Hop 3500 96 7 多拷貝 尖胞鐮刀菌(F. oxysporum) I

28、mpala 1280 27 2 6 尖胞鐮刀菌(F. oxysporum) Ant1 4798 37 2 ? 黑曲霉(Aspergillus niger) Pot2 1857 43 2 100 稻瘟病菌(M. grisea) MGR586 1860 42 ? ? 稻瘟病菌(M. grisea) Flipper 1842 48 ? 020 灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea) 曾用Fot1、Fot2、Impala、Hop這4個(gè)轉(zhuǎn)座子，對(duì)煙曲霉硝酸還原酶結(jié)構(gòu)基因(niaD)和尖胞鐮刀菌硝酸還原酶結(jié)構(gòu)基因(nia)進(jìn)行誘變 在獲得的13個(gè)突變體中，F(xiàn)ot1、Fot2、Impala總是插入在

29、寄主的TA位點(diǎn)。 niaD含有6個(gè)內(nèi)含子，其中5個(gè)Fot1插入在第3個(gè)內(nèi)含子上。 nia含有1個(gè)內(nèi)含子，3個(gè)Fot1 和1個(gè)Fot2插入在外顯子上。Impala插入在niaD的翻譯起點(diǎn)上游(圖)。說(shuō)明轉(zhuǎn)座子的插入是隨機(jī)的，但也具有一定的插入熱點(diǎn)。 圖28 第四節(jié)第四節(jié)酵母中的轉(zhuǎn)座因子酵母中的轉(zhuǎn)座因子* Ty是酵母轉(zhuǎn)座子(transposon in yeast, Ty)的縮寫。Ty與果蠅中的轉(zhuǎn)座子及反轉(zhuǎn)錄病毒前病毒類似，能插入染色體的許多位點(diǎn)，在被插入的Ty因子兩側(cè)靶DNA各有5個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)的重復(fù)序列。Ty轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座頻率要比細(xì)菌轉(zhuǎn)座子的低，大約10-710-8。另外，釀酒酵母中只有Ty因子，而無(wú)

30、其它種類的轉(zhuǎn)座因子。一、一、Ty因子在酵母基因組中的分布情況因子在酵母基因組中的分布情況 在釀酒酵母基因組中，Ty插入占整個(gè)基因組的3.1%。其中主要是單個(gè)LTR(Solo LTR)，它是由于LTR-LTR間的重組使Ty的中央?yún)^(qū)缺少后而產(chǎn)生的。 在這5類Ty中，Ty1和Ty2是種類最多的反轉(zhuǎn)座子，Ty3、Ty4和Ty5數(shù)量較少。其中Ty1/2是由于Ty1和Ty2間的重組而產(chǎn)生的雜合體，見(jiàn)表9 。 表9 釀酒基因組中Ty轉(zhuǎn)座子插入的數(shù)目 類型 Ty因子的總長(zhǎng)度 單個(gè)LTR(不包括ORF)Ty1 & Ty1/2 32 185Ty2 13 21Ty3 2 39Ty4 3 29Ty5 1 6二

31、、二、Ty因子的分子結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄因子的分子結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄1.Ty因子的分子結(jié)構(gòu)因子的分子結(jié)構(gòu)* 1996年完成了酵母全基因組的測(cè)序工作。在釀酒酵母(S. cerevisiae)中，有5類酵母逆轉(zhuǎn)座子，即Ty1-Ty5。Ty的結(jié)構(gòu)與反轉(zhuǎn)錄病毒的相似性比與細(xì)菌轉(zhuǎn)座子的高，酵母中這5類轉(zhuǎn)座子的遺傳結(jié)構(gòu)基本相同，每一結(jié)構(gòu)單位長(zhǎng)6.3kb，轉(zhuǎn)座子的左右兩端是長(zhǎng)度為330 bp的長(zhǎng)末端正向重復(fù)序列LTR (以前被稱為區(qū))，中間是2個(gè)開(kāi)放閱讀框架 TyA和TyB。TyA類似于反轉(zhuǎn)錄病毒中的gag，主要編碼結(jié)構(gòu)蛋白，如核酸結(jié)合蛋白(NA)；TyB類似于反轉(zhuǎn)錄病毒中的pol，編碼參與反轉(zhuǎn)錄的酶蛋白，如蛋白酶(PR)、

32、整合酶(IN)、反轉(zhuǎn)錄酶(RT)、RNase H(RH)等(見(jiàn)圖見(jiàn)圖29)。對(duì)LTR、TyB氨基酸順序分別進(jìn)行聚類分析，以反轉(zhuǎn)錄病毒、果蠅的轉(zhuǎn)座子：Copia 和Gypsy等作為參照對(duì)象，表明這5類Ty 反轉(zhuǎn)座子屬于兩個(gè)組，即Copia組和Gypsy組。* 其中Ty1、Ty2、Ty4及Ty5屬于copia組，而Ty3屬于gyspy組。* 這兩個(gè)組的主要區(qū)別是TyB中整合酶(IN)和反轉(zhuǎn)錄酶(RT)的排列順序不同。在每個(gè)Ty中，其左右兩端的LTR一般是相同的，是由同一種反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生的。 2.Ty因子的轉(zhuǎn)錄和翻譯因子的轉(zhuǎn)錄和翻譯 Ty因子從左側(cè)LTR結(jié)構(gòu)的啟動(dòng)子內(nèi)開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄成兩種mRNA序列，

33、一種RNA的長(zhǎng)度為5 kb，另一種RNA的長(zhǎng)度為5.7 kb(終止于右側(cè)的LTR內(nèi))。TyA和TyB的可讀框以兩種方式表達(dá)(圖30 )。TyA蛋白代表TyA可讀框，并且在其末端終止。但是TyB可讀框只以連接蛋白(TyA-TyB)的一部分被表達(dá)，在這里TyA和TyB區(qū)被一個(gè)特殊的框架遷移所連接，這使終止密碼子被繞過(guò)(與反轉(zhuǎn)錄病毒的gal-pol翻譯相似)。 圖30 三、轉(zhuǎn)座機(jī)制三、轉(zhuǎn)座機(jī)制 Ty 因子的轉(zhuǎn)座機(jī)制是由DNARNADNA，而不像某些細(xì)菌轉(zhuǎn)座因子那樣是由DNADNA方式。圖 31 是Ty反轉(zhuǎn)座子經(jīng)過(guò)RNA中間體的轉(zhuǎn)座過(guò)程的實(shí)驗(yàn)流程。首先將Ty反轉(zhuǎn)座子克隆到質(zhì)粒載體上。然后，將其它基因的一個(gè)內(nèi)含子插入到Ty的編碼區(qū)內(nèi)，并使這個(gè)雜合的Ty因子置于Gal啟動(dòng)子下，接著將這個(gè)重組質(zhì)粒引入到酵母細(xì)胞中。轉(zhuǎn)座的結(jié)