誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞-張嚴(yán)

1、誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞2013.09.02主要內(nèi)容主要內(nèi)容什么是誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞？獲取誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的基本原理誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)與鑒定誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞技術(shù)的研究進(jìn)展誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的優(yōu)缺點(diǎn)誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的發(fā)展歷程與應(yīng)用前景干細(xì)胞干細(xì)胞具有無限制自我更新能力、同時(shí)也可分化成特定組織的細(xì)胞，在細(xì)胞發(fā)育過程中處于較原始階段。包括：胚胎干細(xì)胞 成體干細(xì)胞：上皮干細(xì)胞 造血干細(xì)胞 神經(jīng)干細(xì)胞 肌肉干細(xì)胞 人體胚胎干人體胚胎干(hES)細(xì)胞細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：有潛力在體內(nèi)發(fā)育成任何細(xì)胞類型缺點(diǎn)：(l)供體卵母細(xì)胞的來源困難, ES細(xì)胞建系效率低 (2)免疫排斥反應(yīng)(3)ES細(xì)胞具有成瘤性(4)體外保持ES細(xì)胞

2、全能性的條件非常復(fù)雜(5)倫理學(xué)爭(zhēng)論l胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）來源于哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育早期的胚泡期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，是最原始的干細(xì)胞成體干細(xì)胞 成體干細(xì)胞是指存在于一種已經(jīng)分化組織中的未分化細(xì)胞，這種細(xì)胞能夠自我更新并且能夠特化形成組成該類型組織的細(xì)胞。成體干細(xì)胞存在于機(jī)體的各種組織器官中。成年個(gè)體組織中的成體干細(xì)胞在正常情況下大多處于休眠狀態(tài)，在病理狀態(tài)或在外因誘導(dǎo)下可以表現(xiàn)出不同程度的再生和更新能力。 神經(jīng)干細(xì)胞 造血干細(xì)胞 間充質(zhì)干細(xì)胞 內(nèi)皮干細(xì)胞 iPS通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)(gene transfection)將某些轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入動(dòng)物或人的體細(xì)胞, 使體細(xì)胞直接重構(gòu)成為胚胎干細(xì)胞（embryonic

3、stem cell, ESC）細(xì)胞樣的多潛能細(xì)胞。iPS細(xì)胞不僅在細(xì)胞形態(tài)、 生長(zhǎng)特性、 干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)等方面與ES細(xì)胞非常相似, 而且在DNA甲基化方式、 基因表達(dá)譜、 染色質(zhì)狀態(tài)、 形成嵌合體動(dòng)物等方面也與ES細(xì)胞幾乎完全相同。獲取獲取IPS細(xì)胞的基本原理細(xì)胞的基本原理ES細(xì)胞和IPS細(xì)胞具有相同的基因。ES細(xì)胞中的與細(xì)胞多能性有關(guān)的基因能夠表達(dá)，如：oct4，Sox2等。而已分化的體細(xì)胞中的這些基因不能表達(dá)。通過導(dǎo)入與多能性有關(guān)的外源基因來激活體細(xì)胞中的多能性基因，從而使體細(xì)胞從分化狀態(tài)重編程為多能性干細(xì)胞。iPS發(fā)展歷程發(fā)展歷程2006年日本京都大學(xué)山中伸彌Shinya Yamana

4、ka領(lǐng)導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)室在世界著名學(xué)術(shù)雜志細(xì)胞上率先報(bào)道了iPS的研究。他們把Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4這4種轉(zhuǎn)錄因子引入小鼠胚胎或皮膚纖維母細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)其發(fā)生轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生的iPS細(xì)胞在形態(tài)、基因和蛋白表達(dá)、表觀遺傳修飾狀態(tài)、細(xì)胞倍增能力、類胚體和畸形瘤生成能力、分化能力等都與胚胎干細(xì)胞極為相似。20072007年年末，末，ThompsonThompson實(shí)驗(yàn)室和山中伸彌實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)報(bào)實(shí)驗(yàn)室和山中伸彌實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)報(bào)道道，利用，利用iPSiPS技術(shù)同樣可以誘導(dǎo)技術(shù)同樣可以誘導(dǎo)人人皮膚纖維母細(xì)胞成為幾乎皮膚纖維母細(xì)胞成為幾乎與胚胎干細(xì)胞完全一樣的多能干細(xì)胞。與胚胎干細(xì)胞完全一樣的多

5、能干細(xì)胞。所不同的是日本實(shí)驗(yàn)室依然采用了用所不同的是日本實(shí)驗(yàn)室依然采用了用逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒引入引入Oct3/4Oct3/4、Sox2Sox2、c-Mycc-Myc和和Klf4 Klf4 4 4種因子組合，而種因子組合，而ThompsonThompson實(shí)驗(yàn)室則采用了以實(shí)驗(yàn)室則采用了以慢病毒載體慢病毒載體引入引入OCT4OCT4、SOX2SOX2加加NANOGNANOG和和LIN28LIN28這種因子組合。這種因子組合。這些研究成果被美國(guó)這些研究成果被美國(guó)科學(xué)科學(xué)雜志列為雜志列為20082008年十大科技突年十大科技突破中的第破中的第1 1位。位。20082008年，哈佛大學(xué)年，哈佛大學(xué)Ge

6、orge DaleyGeorge Daley實(shí)驗(yàn)室利用誘導(dǎo)細(xì)胞重新實(shí)驗(yàn)室利用誘導(dǎo)細(xì)胞重新編程技術(shù)把采自編程技術(shù)把采自1010種種不同遺傳病患者病人的皮膚細(xì)胞轉(zhuǎn)變不同遺傳病患者病人的皮膚細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)闉閕PSiPS，這些細(xì)胞將會(huì)在建立疾病模型、藥物篩選等方面發(fā)，這些細(xì)胞將會(huì)在建立疾病模型、藥物篩選等方面發(fā)揮重要作用。揮重要作用。美國(guó)科學(xué)家還發(fā)現(xiàn)，美國(guó)科學(xué)家還發(fā)現(xiàn)，iPSiPS可在適當(dāng)誘導(dǎo)條件下可在適當(dāng)誘導(dǎo)條件下定向分化定向分化，如，如變成血細(xì)胞，再用于治療疾病。變成血細(xì)胞，再用于治療疾病。哈佛大學(xué)另一家實(shí)驗(yàn)室則發(fā)現(xiàn)利用病毒將哈佛大學(xué)另一家實(shí)驗(yàn)室則發(fā)現(xiàn)利用病毒將3 3種在細(xì)胞發(fā)育過種在細(xì)胞發(fā)育過程中起

7、重要作用的轉(zhuǎn)錄因子引入小鼠胰腺外分泌細(xì)胞，可程中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子引入小鼠胰腺外分泌細(xì)胞，可以直接使其轉(zhuǎn)變成與干細(xì)胞極為相似的細(xì)胞，并且可以分以直接使其轉(zhuǎn)變成與干細(xì)胞極為相似的細(xì)胞，并且可以分泌胰島素、有效降低血糖。這表明利用誘導(dǎo)重新編程技術(shù)泌胰島素、有效降低血糖。這表明利用誘導(dǎo)重新編程技術(shù)可以直接獲得某一特定組織細(xì)胞，而不必先經(jīng)過誘導(dǎo)多能可以直接獲得某一特定組織細(xì)胞，而不必先經(jīng)過誘導(dǎo)多能干細(xì)胞這一步干細(xì)胞這一步。20092009年，中國(guó)科學(xué)家于年，中國(guó)科學(xué)家于20082008年年1111月利用月利用iPSiPS細(xì)胞培育出細(xì)胞培育出小鼠小鼠“小小小小”中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所周琪研究員和上海交通

8、大學(xué)醫(yī)中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所周琪研究員和上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院曾凡一研究員領(lǐng)導(dǎo)的研究組合作完成的工作表明，學(xué)院曾凡一研究員領(lǐng)導(dǎo)的研究組合作完成的工作表明，利用利用iPSiPS細(xì)胞能夠得到成活的具有繁殖能力的小鼠，從細(xì)胞能夠得到成活的具有繁殖能力的小鼠，從而在世界上第一次證明了而在世界上第一次證明了iPSiPS細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞具有相細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞具有相似的多能性似的多能性?？茖W(xué)家表示，這一研究成果表明。科學(xué)家表示，這一研究成果表明iPSiPS干細(xì)干細(xì)胞或許同胚胎干細(xì)胞一樣可以作為治療各種疾病的潛胞或許同胚胎干細(xì)胞一樣可以作為治療各種疾病的潛在來源。在來源。國(guó)際學(xué)術(shù)權(quán)威雜志Science雜志刊登了北京

9、大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院鄧宏魁教授和趙揚(yáng)博士帶領(lǐng)的研究團(tuán)隊(duì)在生命科學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)革命性的研究成果用小分子化合物誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程為多潛能干細(xì)胞。該成果開辟了一條全新的實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞重編程的途徑，給未來應(yīng)用再生醫(yī)學(xué)治療重大疾病帶來了新的可能。在這項(xiàng)研究中，鄧宏魁團(tuán)隊(duì)僅使用四個(gè)小分子化合物的組合對(duì)體細(xì)胞進(jìn)行處理就可以成功地逆轉(zhuǎn)其“發(fā)育時(shí)鐘”，實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞的“重編程”。使用這項(xiàng)技術(shù)，他們成功地將已經(jīng)特化的小鼠成體細(xì)胞誘導(dǎo)成為了可以重新分化發(fā)育為各種組織器官類型的“多潛能性”細(xì)胞，并將其命名為“化學(xué)誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞（CiPS細(xì)胞）”。人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的建立-技術(shù)流程 流程圖 Cell Stem Cell,2009

10、人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的建立-克隆挑取 一次性玻璃巴氏吸管，需制備圓口（切割，剝離）和斷口（吸?。﹥煞N 可挑克隆-有光滑邊緣，胚胎干細(xì)胞樣 人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞鑒定 形態(tài)鑒別與AP染色 Realtime PCR 檢測(cè)多能性基因的表達(dá)水平。 免疫熒光鑒定胚胎標(biāo)志物的表達(dá) 多能性基因（Nanog, Oct4）啟動(dòng)子甲基化水平比較 基因芯片鑒定誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞在基因表達(dá)譜上的相似程度 核型鑒定 擬胚體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證分化潛能 畸胎瘤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證分化潛能 人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞鑒定 -形態(tài)鑒別和AP染色 扁平，較高核質(zhì)比 AP染色呈陽性 On feeder (100) AP staining(40) Matri

11、gel (200) qPCR檢測(cè)內(nèi)源多能性基因與轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平 多能性標(biāo)志物的檢測(cè) 甲基化水平檢測(cè)與核型鑒定 擬胚體畸胎瘤形成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證分化潛能 iPS優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)與經(jīng)典的胚胎干細(xì)胞技術(shù)和體細(xì)胞核移植技術(shù)不同，iPS技術(shù)不使用胚胎細(xì)胞或卵細(xì)胞，因此沒有倫理學(xué)的問題。利用iPS技術(shù)可以用病人自己的體細(xì)胞制備專用的干細(xì)胞，所以不會(huì)有免疫排斥的問題。iPS缺點(diǎn)缺點(diǎn)比如，添加4個(gè)“重新編程”基因或取代疾病細(xì)胞中有缺陷基因的方法都可能有導(dǎo)致癌癥的副作用。誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的安全性-成瘤風(fēng)險(xiǎn) 不同來源和方法來的iPSC 神經(jīng)分化能力各不相同， 都不如ESC的分化效率。 不 同 組 織 來 源 的iPSC神經(jīng)分化效率不同，移植的神經(jīng) 球 成 瘤 效 率iPSC 比ESC高。 Yamanaka S. 2009 NBT Zhang S.C. 2010 PNAS IPS細(xì)胞的應(yīng)用前景用于器官移植建立疾病模型，了解發(fā)病機(jī)理治療某些遺傳病 如：患有鐮刀型貧血癥的小鼠皮膚成纖維細(xì)胞建立了IPSc，并將其移植到小鼠體內(nèi)，小鼠的癥狀得以緩解。實(shí)驗(yàn)方案1. 培養(yǎng)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞2. 實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照 Fe3O4/Au RGD-Fe3O4/Au F3-Fe3O4/Au 每次用磁場(chǎng)處理30min，每隔4小時(shí)處理一次，共處理3天，在顯微鏡下實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞的形態(tài)變化。3. MTT 檢測(cè)細(xì)胞數(shù)的變化。（酶標(biāo)儀）